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大肠杆菌O157:H7的检验



录入时间:2011-11-22 16:06:07 来源:食品伙伴网

1、培养基制备:

  改良EC新生霉素增菌肉汤 (mEC): EC肉汤灭菌后添加20mg/mL过滤除菌的新生霉素,使终浓度为20μg/mL。

  改良山梨醇麦康凯琼脂(TC-SMAC):山梨醇麦康凯琼脂加入过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液,使终浓度2.5mg/L,头孢克污,使终浓度为0.05mg/L。
  MUG-LST肉汤:LST肉汤中添加4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG),使终浓度为0.1g/L。

2、增菌培养

  秤取25克样品放入225mL mEC中,均质。于41±1℃培养18-24小时。

3、分离

  将mEC肉汤培养物10倍递增稀释。从10-4,10-5,10-6稀释度,各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1℃培养18~24小时。

  可疑 EHEC O157:H7菌落扁平,透明或半透明,边缘光滑,呈淡褐色中心,直径约2mm。

4、鉴定

  挑取TC-SMAC上的可疑菌落,接种MUG-LST,于36±1℃培养18~24小时,出现产气,且无荧光者,分离到普通营养琼脂。

  对纯菌落用EHEC O157:H7标准血清或胶乳凝集试剂作凝集试验,必要时进行生化试验。

  在检测过程中,也可以在选择性增菌后,取出5mL增菌液,经100℃水浴15分钟灭活后,供自动酶联荧光免疫测试(VIDAS),迅速获得初步结果,阳性反应者需作进一步证实。

                              EHEC O157:H7检验程序图解

检样25g

      mEC225mL → VIDAS快速筛选

  ↓41±1℃,18-24h

10-4,10-5,10-6稀释度涂布TC-SMAC

↓36±1℃,18-24h

挑取5-10个可疑菌落接种MUG-LST

↓36±1℃,18-24h

MUG阴性培养物转种普通营养琼脂

↓     ↓

生化反应鉴定    血清凝集鉴定

       或

         胶乳凝集试验

  用上述方法在样品中分离获得的纯菌落,经抗E.coli O157:H7标准血清或EHEC O157:H7胶乳凝集测试为阳性者,报告检出肠出血性大肠杆菌O157:H7。

  如需要进一步检测Vero毒素基因的存在,可通过接种Vero细胞或Hela细胞,观察细胞病变进行判定,或可使用基因探针检测和聚合酶链反应(PCR)检测法。(参见FDA细菌分析手册第8版)

 

 

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