一、实验目的：学习酵母菌种的质量鉴定方法，

二、实验原理：酵母的质量直接关系到啤酒的好坏。酵母活力强，发酵就旺盛；若酵母被污染或发生变异，酿制的啤酒就会变味。因此，不论在酵母扩大培养过程中，还是在发酵过程中，必须对酵母质量进行跟踪调查，以防产生不正常的发酵现象，必要时对酵母进行纯种分离，对分离到的单菌落进行发酵性能的检查。

三、实验器材与试剂：显微镜，恒温水浴，温箱，高压蒸汽灭菌锅，带刻度的锥形离心管等

0.  025%美兰（又称次甲基兰，Methylene blue）水溶液：0.025g美兰溶于100mL水中；

pH4.5的醋酸缓冲液：0.51g硫酸钙，0.68g硫酸钠，0.405g冰醋酸溶于100mL水中；

醋酸钾（钠）培养基：葡萄糖  0.06%，蛋白胨  0.25%， 醋酸钾（钠） 0.5%，琼脂  2%， pH 7.0。

四、实验步骤：

1. 显微形态检查

载玻片上放一小滴蒸馏水，挑酵母培养物少许，盖上盖玻片，在高倍镜下观察。优良健壮的酵母菌，应形态整齐均匀，表面平滑，细胞质透明均一。年幼健壮的酵母细胞内部充满细胞质；老熟的细胞出现液泡，呈灰色，折光性较强；衰老的细胞中液泡多，颗粒性贮藏物多，折光性强。

2. 死亡率检查

方法同上，可用水浸片法，也可用血球计数板法。酵母细胞用0.025%美兰水溶液染色后，由于活细胞具有脱氢酶活力，可将兰色的美兰还原成无色的美白，因此染不上颜色，而死细胞则被染上兰色。

一般新培养酵母的死亡率应在1%以下，生产上使用的酵母死亡率在3%以下。

3. 出芽率检查

    指出芽的酵母细胞占总酵母细胞数的比例。随机选择5个视野，观察出芽酵母细胞所占的比例，取平均值。一般生长健壮的酵母在对数生长阶段出芽率可达60%以上。

4. 凝集性试验

对下面发酵来说，凝集性的好坏牵涉到发酵的成败。若凝集性太强，酵母沉降过快，发酵度就太低；若凝集性太弱，发酵液中悬浮有过多的酵母菌，对后期的过滤会造成很大的困难，啤酒中也可能会有酵母味，

凝集性可通过本斯试验来确证：将1g酵母湿菌体与10mL pH4.5的醋酸缓冲液混合，20℃平衡20分钟，加至带刻度的锥形离心管内，连续20分钟，每隔1分钟记录沉淀酵母的容量。实验后，检查pH是否保持稳定。

一般规定10分钟时的沉淀酵母量在1.0mL以上者为强凝集性，0.5mL以下者为弱凝集性。

5. 死灭温度检测

死灭温度可以作为酵母菌种鉴别的一个重要指标，一般说来，培养酵母的死灭温度在52~53℃之间，而野生酵母或变异酵母的死灭温度往往较高。

温度试验范围一般为48~56℃，温度间隔为1或2℃，在已灭菌的麦汁试管中（内装5mL 12%麦汁）接入培养24小时的发酵液0.1mL，放于恒温水浴内，每一样品做3个平行试验，并在另一同样的试管中放入温度计，待温度计达到所需温度时开始计时，保持10分钟后，置冷水中冷却，25℃培养5~7天，不能发酵的温度即为死灭温度。

6. 子囊孢子的产生试验

    子囊孢子的产生试验也是酵母菌种鉴别的一个重要指标。一般说来，培养酵母不能形成子囊孢子，而野生酵母较易形成子囊孢子。

    将酵母菌体接种于醋酸钾培养基上，25℃培养48小时后，用显微镜检查子囊孢子产生情况。

7. 发酵性能测定

酵母的发酵度反映酵母对各种糖类的发酵情况，有些酵母不能发酵麦芽三糖，发酵度就低，有些酵母甚至能发酵麦芽四糖或异麦芽糖，发酵度就高。

将150mL麦汁盛放于250mL三角烧瓶中，灭菌，冷却后加入泥状酵母1g，置25℃温箱中发酵3~4天，每隔8小时摇动一次。发酵结束后，滤去酵母，蒸出乙醇，添加蒸馏水至原体积，测比重（见实验十）。

（1）外观发酵度＝（P - m）/P ×100％

式中  P——发酵前麦芽汁浓度

m——发酵液外观浓度（不排除乙醇） 

（2）实际发酵度＝（P - n）/P ×100％，    ·

n——发酵液的实际浓度（排除乙醇后）

   一般外观发酵度应为66~80%，真正发酵度为55~70%

说明：啤酒酵母主要有两类：

(1)上面发酵啤酒酵母：进行上面发酵，发酵温度相对较高（15~20℃），发酵结束后，大部分酵母浮在液面。例如英国著名的淡色爱尔啤酒(A1e)，司陶特(Stout)黑啤酒等。

(2)下面发酵啤酒酵母：进行下面发酵，发酵温度在10℃左右，发酵结束后，大部分酵母沉于容器底部。例如捷克的比尔森(Pilsen)啤酒，德国的幕尼黑啤酒和多特蒙德啤酒，丹麦的嘉士伯啤酒等，我国的啤酒多属于此类型。

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