超广谱β-内酰胺酶的测定 Detection of extended -spectrum β-lactamases (ESBLs)

超广谱β-内酰胺酶(ESBLs) 是指由质粒介导的、能赋予细菌对头孢菌素类(如头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶)和单酰胺类(氨曲南)以及青霉素类抗生素耐药的一类酶。β-内酰胺酶不仅对某些抗生素的作用和地位带来威胁，还对感染性疾病的治疗和人类健康产生严重的影响。 由于部分产 ESBLs 菌株在常规体外药敏试验中，对含氧亚胺基的头孢菌素和氨曲南等抗生素可能表现为敏感，而在感染患者体内却耐药，常造成临床治疗失败。 目前用于超广谱β-内酰胺酶筛选的试验主要有初筛试验和表型确证试验(包括E 试验法) ，另外还有产色素头孢菌试验等。 超广谱β-内酰胺酶检测主要用于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌。

（一） 初筛试验和表型确证试验

初筛试验和表型确证试验均有纸片法和稀释法两种，这里以纸片法为例来解释初筛试验和表型确证试验的检测。

1.初筛试验 按常规纸片扩散法在 M-H 平板上涂布好待检菌，贴头孢曲松 30μg/片(或头孢噻肟 3 0 μg/片，或头孢他啶30μg/片，或氨曲南 30μg/片，或头孢泊肟 10μg/片;使用一种以上的药物可以增加检出敏感度) ， 35℃孵育 18 ~20 h 。 结果判断: 头孢泊肟≦17 mm，头孢他啶≦22 mm，氨曲南≦27 mm，头孢噻肟≦27 mm，头孢曲松≦25 mm，提示可能产生 ESBLs。

注：进行 ESBLs 初筛试验，肺炎克雷伯菌 ATCC700603 可以提供质量评估(例如培养、能力或试验效果) 。

肺炎克雷伯菌 ATCC700603 或大肠埃希菌 ATCC25922 可以用于常规的质量控制(例如每周或每日) ，对于肺夹克雷伯菌 ATCC700603 ，头孢泊肟抑菌圈 9 ~16 mm，头孢他啶抑菌圈 10~ 18 mm，氨曲南抑菌圈 9 ~17mm，头孢噻肟抑菌圈 17 ~25 mm，头孢曲松抑菌圈 16~24 mm。

2 . 表型确证试验 按标准纸片扩散法药敏试验，将菌液涂布到M- H 平板后，分别贴头孢他啶(30μg)和头孢他啶/克拉维酸(30μg/ 10μg) 纸片，或头孢噻肟(30μg) 和头孢噻肟/克拉维酸(30μg/ 10μg) 纸片(确证实验需要同时使用头孢他啶和头孢噻肟，单独和联合克拉维酸复合试剂) ，各纸片之间的间距≧24 mm。35℃ 孵育 18 ~20 h ，观察结果。 2个药物中有任何一个，在加入克拉维酸后，抑菌圈直径与不加克拉维酸的抑菌圈相比，增大值≧ 5mm 时，即判定为产 ESBLs( 如：头孢他啶的抑菌圈为 16 mm，头孢他啶/克拉维酸的抑菌圈为21 mm) 。

注：进行 ESBL 确诊试验时，需要测试肺炎克雷伯菌 ATCC700603 和大肠埃希菌 ATCC25922( 每周或每日) 。 对于大肠埃希菌 ATCC25922 ，所测试的药物联合克拉维酸的复合制剂后的抑菌圈与单药的抑菌图相比，增大值当在≦2mm。 对于肺炎克雷伯菌 ATCC700603 ，头孢他啶联合克拉维酸的复合制剂的抑菌圈，与单独的头抱他咬的抑菌圈相比，增大值≧5 mm，头孢噻肟联合克拉维酸的复合制剂的抑菌圈，与单独的头孢噻肟的抑菌圈相比，增大值≧3 mm。

（二）E 试验法筛选试验

属于表型确证试验。 按纸片琼脂扩散法制备菌液和接种平板，待菌液稍干，将 ESBL 试条贴于平板上，有刻度面朝上，35℃ 孵育 18~24 h 后，读取试条两端的 MI C 值，头孢他啶与头孢他啶十克拉维酸或头孢噻肟与头孢噻肟+克拉维酸的比值≧8. 判定 ESBLs 阳性，否则阴性。

（三） 产色头孢菌素试验

原理：头孢酶纸片是浸有色原底物的头孢菌素，即头孢硝噻吩的纸片，当β-内酰胺酶水解当β-内酰胺环中的氨基键时，此化合物发生快速的颜色变化，由黄变红为阳性。

方法：将待检菌株涂在含产色头孢菌素(nitrocefin.  NI)的试纸条上，如该菌株产当β-内酰胺酶，则在 10 min 之内，试纸上涂有细菌的部位颜色由黄变红。 这是一个快速定性检测当β-内酰胺酶的方法，阳性结果说明该菌产当β-内酰胺酶，但不一定是 ESBLs。

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