一、厌氧菌样品的采集Collection of anaerobic bacteria' s specimens

标本避免正常菌群污染和氧接触，采用下列方法。

(1) 脓胸及未破溃的脓肿：皮肤消毒后， 以无菌注射器抽取(排尽空针及针头内的气体) ，将针头插入无菌橡皮塞内送检。

(2) 肺分泌物和痰标本：用支气刷采取或环甲膜穿刺术。

(3) 尿液标本：用元菌注射器从耻骨上缘行膀脱穿刺术抽取。

(4) 血液标本：可用两端接有无菌针头的塑料袋或橡皮导管，将一端针头刺入静脉，待血液流出后将另一端针头立即插入培养瓶内(瓶内负压) ，使血液直接流入培养瓶内。

(5) 窦道、深部脓肿等的标本:可用特别采样器采取。

二、涂片与染色Smear preparation and stain

标本涂片、革兰染色、镜检，观察细菌的形态和染色性，并估计标本中大致的含菌量，可用"少量” " + "、" ++ "、" + ++"、" ++++ "表示。镜检不仅能反映各种厌氧菌的特殊形态，同时也能为鉴定厌氧菌提供参考和依据。如脆弱拟杆菌菌体细长，两端尖：韦荣球菌是极小的革兰阴性球菌。厌氧菌芽胞的位置、形态、大小对鉴定很有意义，必要时作芽胞形成试验。例如，芽胞在菌体极端且大于菌体呈鼓槌状，是破伤风梭菌的特征。根据庆氧菌的特殊形态，可初步确定有无厌氧菌感染，及时向临床医师发出一级报告，建议采用哪类药物。

三、标本接种Inoculating

一般标本接种3 个血琼脂平板，分别放置于有氧、无氧和含5 %~ l0 % CO2 的环境中培养。如果只要求检出厌氧菌，只需接种l 个庆氧血琼脂平板，也可增加1 个相应的选择庆氧血琼脂平板。为便于在混合培养中及早发现庆氧菌，一般将标本分3 段划线接种，在第1 和第2 段交界处贴1 张甲硝哗(5 mg/片)纸片，若出现隐约抑菌圈，则提示有庆氧菌生长。

不同庆氧菌的生长速度和菌落形态各异，色素也有不同，荧光产生与否也有助于鉴定，根据上述特征，可初步推测厌氧菌的种类。

1.革兰阴性杆菌

(1)在BBE 琼脂平板上有灰黑色、直径> lmm 的菌落，菌落周围有黑色的晕，可初步鉴定为脆弱拟杆菌。

(2) 在卡那万古溶血琼脂平板上，有棕色或黑色菌落，或用伍德灯照射有砖红色荧光者，为产黑素普雷沃菌。

(3)菌落沉入琼脂内，使培养基表面留有小坑者，可能是解脲拟杆菌和纤细拟杆菌。

(4) 菌落表面有小斑点，或如面包屑，结合涂片所见，可初步鉴定为具核梭杆菌。

2. 革兰阴性球菌 菌体很小，排列成双、短链或小堆，菌落小，不透明，可能是小韦荣球菌。

3. 革兰阳性球菌排列成长短不等的链，可能是消化链球菌。

4. 苹兰阳性无芽胞杆菌

(1)菌落呈臼齿形、粗糙，结核脓样分泌物中有硫黄样颗粒，可能是放线菌。

(2) 菌体呈X 、Y 、V 排列，菌落小，灰白，不透明，可能是丙酸杆菌。

5 . 革兰阳性芽胞杆菌 只要见有芽胞，即可鉴定为梭菌属。菌落有双环溶血，卵黄平皿上卵磷脂酶试验和Nagler 试验阳性，涂片染色为革兰阳性短粗杆菌，有芽胞，有荚膜，可鉴定为产气荚膜梭菌。

四、耐氧试验Oxygen tolerance test

当庆氧平板上有细菌生长时，为了确定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。从每个琼脂平板上挑取4~5 个性状不同的菌落，每个菌落分别转种于2 块需氧血琼脂平板和1 块厌氧血琼脂平板(每个琼脂平板可划4~6 区，每区种一个可疑菌落) ，然后将平板分别放置在需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。

凡在厌氧环境生长，而在需氧和二氧化碳环境中不生长的细菌为专性庆氧菌(图3 - 48 中A 区) ;在需氧和厌氧环境中均能生长者为兼性厌氧菌(图3 - 48 中B 区) ;在需氧和二氧化碳环境中生长，而在厌氧环境中不生长者为专性需氧菌(图3 - 48 中C 区) ;在需氧、厌氧环境中均不生长或生长不佳，而在二氧化碳环境中生长良好的细菌为需二氧化碳菌(图3 - 48 中D 区) 。

五、鉴定试验Identification test

可依据厌氧菌的菌体染色形态、菌落特性以及对某些抗生素的敏感性作出初步鉴定。最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等检查。

生化试验主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂酶试验、明胶液化试验及胆汁肉汤生长试验和硫化氢试验等。目前用于厌氧菌快速鉴定有胞外酶试验， 4 h 即可观察结果;自动微生物鉴定系统，如VITEK-ANI 、MicroScan- ANI 等也可鉴定庆氧细菌。

在进行庆氧菌分离鉴定的过程中，需注意下列事项: ①厌氧菌标本在采集和运输的过程中必须与空气隔绝(厌氧菌暴露于空气中时间太长可死亡) ，务必在30 min 内完成，同时应避免正常菌群的污染。②培养基要新鲜配制，若储存太久，有氧气溶解在表面或有过氧化物在培养基中，不利于庆氧菌生长。③ 若菌落太小，需用放大镜观察菌落。④作耐氧试验，要求从每个琼脂平板上挑取4 ~ 5 个性状不同的菌落，分别接种需氧和厌氧血琼脂平板，置于需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。⑤ 如作胞外酶鉴定， 一定要有足够的菌液浓度。

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