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应用点杂交技术检测病毒—生物素标记探针法



录入时间:2011-11-8 14:35:02 来源:互联网

一、目的

    采用光敏生物素作光照标记则可以避免以上不足,本实验利用长臂光敏生物素标记,由于克服了空间位阻,使检测灵敏度成百倍地提高(其灵敏度已接近放射性同位素的水平)。
    用长臂光敏生物素标记的核酸探针与固定在硝酸纤维膜(NC膜)上的样品核酸分子进行斑点杂交,洗净后用抗生物素-碱性磷酸酶复合物(AV-AP)作酶标,与底物BCIP+NBT显色反应,即可观察检测结果。本实验目的即采用这一方法标记病毒特异片段作为探针,以期在核酸分子水平上检测特定的病毒。 

二.实验材料和用具

    1.材料
    作为模板用的病毒外壳蛋白基因DNA片段,待测大田样品,阳性株、病毒或质粒。
    2.试剂
    长臂光敏生物素核酸探针标记和检测试剂盒:购自华美生物制品公司(军事医学科学院放射医学研究所生产)
    硝酸纤维素膜(NC膜):Bio-rad公司产品,产品号162-0116
     甲酰胺:Fluka公司产品
    牛血清白蛋白(BSA):北京红星生物化学制品厂产品
    普通化学药品由国内各化学试剂厂生产

三.实验步骤

    1.光敏生物素标记GFV-cDNA探针于暗室中,将制备的待标记病毒-cDNA(0.5-1.0ug/ul,无用Tris溶解)定量加入小离心管中,加入等体积至倍量的光敏生物素溶液(1 μl/ μl),充分混匀。将小离心管插入冰浴盒中,开启光标记灯(250W汞灯)灯头距液面10cm,光照20-25min。光标完毕,反应液为红褐色,加dH2O至总体积为100 μl ,加入100 μl仲丁醇,振荡混匀,离心1min,小心吸去上层丁醇相,再如上重复加仲丁醇萃取一次,吸去仲丁醇。仲丁醇提取2次后,水相体积应减少至40 μl,水相呈淡红色。在此液中,加入5 μl3MNaAc充分混匀,加100 μl冷无水乙醇,置于-20℃过夜。4℃离心15min。弃上清,用冷80%乙醇洗一次。沉淀真空干燥。沉淀溶于少量ddH2O,配制成母液。-20℃保存,用时稀释。

    2.核酸斑点杂交
    样品的制备:参见前面关于病毒RNA、总RNA的提取。样品在斑点杂交前先经热变性处理。
    膜的处理:NC膜用2XSSC溶液湿润均匀,放在滤纸上,37℃晾干。
    点样:用Tip头吸取样液1-5 μl ,分多次点样于NC膜上一点,使斑点尽可能的小,同时NC膜上要作记号。
    烘干:放于一铺有洁净滤纸的培养皿中,80℃烘烤2小时。

    配备预杂交液和杂交液:(每cm2 膜用80 μl的量,以下为5 ×10cm2用4ml)。

    3:用前煮沸10min变性,速置冰水中冷却,再加入。

    预杂交:将杂交条放入小管中,加入预杂交液2ml,42℃摇动2-4h。
    杂交:将杂交条换入另一小管中,加入杂交液2ml,42℃摇动20-24h。
    洗涤:将膜取出,放入平皿中,用杂交洗涤液A :2 ×SSC,加0.1%SDS洗三次,每次5min,室温加振荡。
    将膜放于三角瓶中,用杂交洗涤液B :0.1 ×SSC,加0.1%SDS65℃振荡洗三次,每次5min。轻轻吸干滤膜,放入另一皿中,准备显色。

    4.显色
    封闭:用2ml3%BSA封闭液(3gBSA溶于70mldH2O中,用浓HCl调pH至3.0,煮沸20min 后,冷至室温,用 10mMNaOH 调pH 至7.5 ,加入10ml 缓冲液: 1MTris- HClpH7.520mMMgCl2 ,0.05%(V/V)TritonX-100 ,5.8gNaCl 。加水至100ml),42 ℃封闭2-4h 以上(封闭液在4℃保存可重复使用3次,5 ×10cm2膜使用4ml)。
    酶联:将膜取出,放入2ml抗生物素蛋白AV与AP酶偶联复合体溶液中,室温避光保温15min ,轻轻振荡。AV-AP 液:缓冲液:100mMTris-ClpH7.5 ,1.0MNaCl ,2mMMgCl2,0.05%(V/V)TritonX-100。4ml缓冲液内加入AV-AP8-16U,适合5 ×10cm2
膜的用量。AV-AP溶液在4℃保存可反复使用多次。
    洗涤:用洗涤液A ,B 各洗三次,每次5min 。显色洗涤液A :100mMTris-ClpH7.5,1.0MNaCl,2mMMgCl2 ,0.05%(V/V)TritonX-100 。显色洗涤液B:0.1mMTris-
ClpH7.5,0.5MNaCl,0.5%Tween-20。
     显色:将膜放入另一管子中,加入新配制的底物溶液2ml ,再加入BCIP(1)10 μl,NBT(2)10 μl,避光放置。显色数分钟至数小时。阳性结果为出现兰紫色斑点。本底未出现前即可倾出显色液终止。
     底物溶液:100mMTris-ClpH9.5,100mMNaCl,5mMMgCl2 。(1)BCIP10mg溶于200
μl 甲酰胺中。(2)NBT15mg溶于200 μl70% 甲酰胺中。此二液均可在-20℃保存。

    终止反应:用终止液(10mMTris-ClpH7.5,1.0mMEDTA)洗一次,dH2O冲洗净,封存于聚乙烯袋中,避光保存。选择膜湿润状态拍摄结果。

 

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