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植物病毒的RT-PCR检测技术



录入时间:2011-11-7 15:06:28 来源:互联网

一. 目的

    掌握RT-PCR技术的一般原理和操作步骤

二.原理

     PCR(聚合酶链式反应)技术是利用从嗜热水生菌(Thermasaquaticus)中提取或经基因重组合成的耐热DNA聚合酶(常用TaqDNAPolymerase)在高温下快速扩增位于两段已知序列之间DNA片段的技术。PCR过程包括:一.DNA模板的变性(94-95℃),二.单链DNA模板与引物的退火(45-55℃),三.引物的延伸(72℃),这三步经25-30个循环而完成了PCR的全过程 。

三.材料、试剂及仪器

    病毒侵染的植株和健康对照总RNA或病毒RNA,3 ’特异性引物1,5’特异性引物2 ,AMV 反转录酶,5X 反转录buffer ,10mMdNTP,TaqDNAPoiymerase ,10 ×TaqDNAPoiymeraseBuffer(内含50mM/LKCL 、10mM/LTris.Cl(pH8.3)、1.5mM/LMgCL),ddH2O。 

液体石蜡,小离心管,移液器,PCR扩增仪。

四.步骤

1.反转录(RT )

反应体系:
            ddH2O              μl
            5X反转录Buffer        10μl
            10mMdNTP           3 μl
            RNasin             40u
            模板RNA              0.1-1 μg
            3’端特异引物            0.1 μg
            AMV反转录酶            10
            总体积                50 μl

反应条件:42℃ 1-2小时。

2.PCR扩增

反应体系:
            ddH2O                      μl
            10×PCRbuffer               10μl
            10mMdNTP                   0.5 μl
            5’引物(0.1ug/ μl)            1μl
            3’引物(0.1ug/ μl)            1μl
            TaqDNAPolymerase           2-5u
            模板反转录产物                    1-5μl
            总体积                        50 μl
            石蜡油                        70 μl

    反应步骤:

循环变性退火聚合
1    94℃ 5分钟   55℃ 1分钟   72℃ 2分钟
2    94℃ 1分钟   55℃ 1分钟   72℃ 2分钟
末轮循环   94℃ 1分钟   55℃ 1分钟   72℃ 7分钟

3.  电泳检测与分析

    PCR反应完毕,取6-8 μl反应产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,选择合适的DNA 分子量标准作对照。

 

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