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植物病毒RNA的琼脂糖凝胶电泳



录入时间:2011-11-4 15:50:15 来源:互联网

一. 目的

    DNA.RNA 的分离,纯化及鉴定用的凝胶电泳有两类,一类是琼脂糖凝胶电泳,适用于0.2kb和小于30kb的核酸分离;另一类是聚丙烯酰胺凝胶电泳,适用于小于1kb的核酸分离。
    核酸研究中琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速分离、纯化和鉴定DNA和RNA的方法,通过本实验掌握植物病毒RNA的电泳分离技术,了解电泳中凝胶浓度、核酸分子大小及构象、电泳缓冲液和电压与分离效果的密切关系。

二.实验材料

    各种提纯病毒RNA、病叶总RNA或dsRNA。

三.实验用仪器及药剂

    稳压稳流电源;水平电泳槽;核酸紫外灯或凝胶成像分析仪;
    电泳缓冲液:Tris-硼酸(5 ×TBE)液:Tris108g ,EDTA9.3g(配成0.5MPH8.0 的母液),硼酸55g,溶于1000ml.pH8.2,长期保存,用时稀释。
    凝胶加样缓冲液(10 ×):0.25%溴酚兰(BPB),40%(W/V)蔗糖水溶液,4℃保存。
    溴化乙锭(EB)染色液:10mg/ml溶于水

四.实验步骤

  (一)琼脂糖凝胶制备

    1.1%浓度琼脂糖胶:据凝胶板大小计算凝胶液总量,称取琼脂糖粉,溶于0.5 × TBE电泳缓冲液中
    2.置沸水浴或微波炉中加热至沸腾,至少2次,以使琼脂糖充分溶解
    3.冷却至55-60℃左右加入溴化乙锭(EB),浓度为0.5ug/ml,充分混匀

    4.在胶床开口的两端用胶布或胶纸封好,确保倒胶不漏,置水平台面上
    5.梳子固定在小凹槽内,,梳子平面与胶床底面垂直,梳齿前端和胶床底面留有0.5~1mm间隙

    6.将凝胶倒入胶床中,床高3~5mm,30分钟~1小时后胶凝固,撕掉胶布
    7.将胶床置于电泳槽中,加入1×电泳缓冲液,缓冲液的量以超出凝胶表面1~2mm为宜,小心地拔出样品梳子,样品孔自然充满缓冲液,如样品孔内有残留气泡应除去

    (二)上样与电泳

    1.RNA样品中加入0.1-0.2倍体积10X凝胶加样缓冲液,混匀后用微量移液器吸取样品点入样品孔中,同时加已知分子量的参照样品。
    2. 电泳时靠加样孔的一头接负极(黑色),打开电源开关,电压调至所需伏数(小于5V/cm),当染料颜色移至适宜位置处足够分离目的核酸时(0.5-2小时左右)停止。 
    3. 电泳完毕,将电泳仪电压调回到零位后关电源,从胶床上取下凝胶置紫外检测仪上(波长254nm)或在凝胶成像分析仪上进行观察、分析,并记录结果。 
    照相:在相机上加红色滤色镜光圈放到4~5.6,用21NID胶卷,速度约在0.5~2分钟间。 
    4.分析病毒核酸组分并根据照片测算核酸分子量,以及核酸质量和浓度。

    注意:EB有诱变作用及中性毒性,操作时应带手套或充分注意。RNA 电泳所用试剂应专用,防止RNA酶降解。

 

 

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