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植物病毒血清学检测—酶联免疫吸附技术(ELISA):(Fab')-ELISA



录入时间:2011-11-3 16:37:13 来源:互联网

一. 目的

     (Fab')2-ELISA是酶联免疫吸附测定中最灵敏的检测方法之一,配合背景反应很浅的碱性磷酸酯酶检测下限可以达到纳克水平,对于少量样品或含量低的病毒检测效果好。它利用蛋白酶去掉抗体IgG中的Fc片段,使双抗体夹心的优点只使用一种抗体就可以实现。

二.实验材料和用具

   1.专化性抗体免疫球蛋白IgG(浓度约为1mg/ml)

   2.系统感染病毒的植株和健康植株

   3.酶标记羊抗兔抗体球蛋白IgG(市售)或A蛋白标记的碱性磷酸酯酶(Sigma产品)。

   4.酶联板、微量加样器、洗瓶、酶联读数仪

   5.抗原包被缓冲液、洗涤缓冲液、IgG稀释缓冲液、底物溶液

三.实验步骤

   1.配制缓冲液
    (1).抗原包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液,pH9.6)
    Na2C031.59g;NaHCO32.93g;NaN30.2g蒸馏水加至1升。

    (2).洗涤缓冲液(0.02MPBS-吐温缓冲液,PBS-T,pH7.4)
    NaCl8.0g ;Na2HPO4 '12H2O2.9g;KH2PO4 0.2g; 
    KCl0.2g;NaN30.2g;蒸馏水加至1升后加Tween-200.5ml.

    (3).IgG稀释缓冲液(0.02MPBS-T,牛血清白蛋白溶液)
    取0.1g牛血清白蛋白溶于用灭菌蒸馏水配制的PBS-T缓冲液100ml中即成。
    (4).底物溶液(邻苯二胺溶液)
    a液:柠檬酸19.2克加水溶至1000ml为0.1M柠檬酸溶液
    b液:Na2HPO4.12H2O71.6g加水溶至1000ml为0.2MNa2HPO4溶液。 
    取a液24.3ml加b液25.7ml混合即成磷酸盐-柠檬酸缓冲液pH5.0 。
    称取40mg 邻苯二胺,溶解后过滤,加上述缓冲液至100ml ,临用前加30 %H2O2 0.15ml即成(注意邻苯二胺也需新鲜配制)。

    (5).碱性磷酸脂酶底物缓冲液:
二乙醇胺缓冲液:二乙醇胺97ml,蒸馏水800ml,混合,用浓HCl调pH=9.8 ,加水至1000ml。取硝基酚磷酸pNPP60mg溶于100ml上述二乙醇胺缓冲液中,即为底物缓冲液(现配现用,时间长了会变色)。
    碱性磷酸脂酶标记的A蛋白(Sigma产品),溶于1.0ml50%甘油中即可使用。 
    2.取显症叶片和健康叶片用抗原包被缓冲液分别配制1 ∶10,1 ∶100,1 ∶1000 样品悬浮液,过滤或低速离心后备用。
    3.按设计(同实验三)在酶联板上加样,每孔200 μl,(Fab')2 以1/2000-4000的比例稀释
在50mM包被缓冲液(pH9.6)中;在30℃下孵育四小时,或4℃过夜(时间长,包被好);
    4.洗板三次同实验三;
    5.样品稀释在提取缓冲液中,4℃下孵育过夜;洗板同前;
    6.IgG(可用未纯化的抗血清) 以1/2000-4000的比例稀释在提取缓冲液中,30℃孵育三小时,洗板同前;
    7.酶标A蛋白以1/2500比例稀释在提取缓冲液中,30℃孵育三小时,洗板同前;
    8.加底物,室温孵育不超过30分钟(过氧化物酶),2-4小时(碱性磷酸酯酶),用酶联免疫检测仪测定结果。

 

 

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