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植物病毒血清学检测—酶联免疫吸附技术(ELISA):间接ELISA



录入时间:2011-11-3 16:25:59 来源:互联网

 一. 目的

      酶联免疫吸附测定(ELISA)是将抗原和抗体包被在固相支持物上,使免疫反应在固体表面进行,并借助与反应的抗体上所标记的酶和底物生成的有色产物进行检测。酶联法有多种形式,本实验介绍最简便和常用的间接法。

二.实验材料和用具

    1.专化性抗体免疫球蛋白IgG(浓度约为1mg/ml)

    2.系统感染病毒的植株和健康植株

    3.酶标记羊抗兔抗体球蛋白IgG(市售)

    4.40孔或96孔酶联板
    5.酶联免疫检测仪。台式离心机。冰箱。
    6.微量取液器(40-200 μl可调,1000ul可调,20ul可调);洗瓶。
    7.包被缓冲液;洗涤缓冲液;IgG稀释缓冲液;底物溶液;邻苯二胺(OPD);过氧化氢(H2O2 );2M硫酸。

    8.10ml、200ml量筒;5ml 、10ml、100ml、500ml烧杯;50ml三角瓶;100ml、500ml容量瓶;研钵;记号笔;小塑料袋;2-5ml可调洗涤瓶。

三. 配制缓冲液

    (1)抗原包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液,pH9.6)
   Na2C031.59g;NaHCO32.93g;NaN30.2g,蒸馏水加至1升。

    (2).洗涤缓冲液(0.02MPBS-吐温缓冲液,PBS-T,pH7.4)
   NaCl8.0g ;Na2HPO4 '12H2O2.93g;KH2PO4 0.2g; 
   KCl0.2g;NaN30.2g;蒸馏水加至1升后加Tween-200.5ml.

    (3).IgG稀释缓冲液(0.02MPBS-T,牛血清白蛋白溶液)

    取0.1g牛血清白蛋白溶于用灭菌蒸馏水配制的PBS-T缓冲液100ml中即成。

    (4).底物溶液(邻苯二胺溶液)pH5.0

    柠檬酸2.55g;Na2HPO4 ,12H2O9.2g加蒸馏水500ml 
    
称取40mg邻苯二胺(OPD),溶解后过滤,加上述缓冲液至100ml,临用前加30%H2O20.15ml即成(注意邻苯二胺也需新鲜配制). 
        

四.实验步骤

    1.包被抗原:取显症叶片和健康叶片用抗原包被缓冲液分别配制1∶10,1 ∶100,1 ∶1000样品悬浮液,过滤或3000rpm低速离心后备用。
    2.按设计(可以参考附图设计)在酶联板上加样,每孔200 μl,加盖后4℃冰箱过夜(或25℃温箱孵育3-5小时或37℃孵育2小时)。
    3.用IgG稀释缓冲液配制特异性抗体IgG稀释液100μg/ml,10μg/ml,2 μg/ml,4℃保存备用。
    4.洗涤:倒尽酶联板上的抗原溶液,用洗涤缓冲液冲洗三次,每次3分钟。
    5.加抗体:按设计加入特异性抗体IgG,每孔150μl,25℃温箱孵育2-5小时。
    6.洗涤三次,同前。
    7.用IgG稀释缓冲液配制酶标羊抗兔IgG(工作浓度按说明书)。
    8.加酶标羊抗兔IgG,每孔100μl,室温或25℃温箱中孵育2-5小时。
    9.洗涤三次,同前。
    10.底物:加底物溶液,每孔150μl,室温20-30分钟。
    11.终止:每孔加一滴2M硫酸终止反应。
    12.目测以颜色深浅记录+++,++,+,±,-。
    13.用酶联仪(波长492毫微米)记录O.D值,比阴性对照读数高二倍以上者一般判断为阳性。
    注意:必须设置空白对照、健康对照和阳性对照;每个样品应2-3次重复;反应结束应立即用酶联检测仪读数,否则读数不准确。

 

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