对流免疫电泳也称为免疫电渗电泳,抗原在碱性缓冲液(大于等电点pH8.2 以上)中带负电,在电场中向正极移动;而抗体球蛋白接近于等电点,借电渗液流的作用与抗原的迁移方向相反,缓慢移向阴极。故通过适当安排抗原和抗体孔的位置,在短期内(30-60分钟)抗原和抗体可以相遇,结果在两孔间形成沉淀线。
1. 实验材料和用具
(1)抗血清
(2)纯化病毒或病汁液
(3)0.05M巴比妥缓冲液,pH8.6,10%NaN3,1.5%SDS,琼脂糖(电泳用)。
(4)载玻片、打孔器、微量加样器、饭盒、电泳仪和水平电泳槽、4℃冰箱。
2. 实验步骤
(1)洗净载玻片,泡在乙醇中,使用前取出擦干备用。
(2)用缓冲液配制1%琼脂糖凝胶,煮化后加入0.02%NaN3,80℃水浴中备用。
(3)在微量离心管中将等量的1.5%SDS和提纯病毒混匀,开水浴中煮2-4分钟备用。
(4)用吸管吸取2ml琼脂糖凝胶,加在载玻片上,注意保持液面水平,分布均匀,厚度为2mm,室温下放置15分钟,移入冰箱10分钟使其充分凝固。
(5)在凝胶上打孔,根据样品数量打两排孔,孔径3mm,孔距3mm,排距5mm,分别标记为阳极和阴极。
(6)去掉孔内凝胶,抗原和待测样品(可以作适当稀释)包括阳性和正常对照样品加在阴极侧一排孔中,注意不要溢出(1mm厚的凝胶加10μl);在另一排孔中加入抗体(可用PBS稀释)。
(7)将玻片放入水平电泳槽,用纱布或滤纸连好电桥,抗原孔端联负极,抗体孔端联正极。以0.05M 巴比妥pH8.6为电泳缓冲液,电流量为4V/cm片,电泳30-60分钟,待沉淀线可见为止。
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