实验室诊断主要包括以检测致病菌及其抗原、产物或核酸为目的的细菌学诊断，以及检测患者血清中特异性抗体为目的的血清学诊断。
一、细菌学诊断
（一）标本采集
细菌感染性疾病的实验室检查结果主要取决于临床标本的质量、采集时间及方法、实验人员的技术熟练程度及经验。临床医生应该知道何时和怎样采取标本，需作哪些实验室检查，以及如何解释结果。为提高致病菌检出率，避免诊断错误或漏检，标本采集与送检过程应遵循下列原则：
1．严格执行无菌操作，尽量避免患者正常菌群或外界环境中杂菌污染标本。采取局部病变标本处，不可用消毒剂，必要时宜以无菌生理盐水冲洗，拭干后再取材。从呼吸道、消化道、泌尿生殖道、伤口或体表分离可疑致病菌时，应与其特定部位的正常菌群及临床表现一并加以考虑，因为目前内源性感染呈不断上升趋势。
2．根据致病菌在患者不同病期的体内分布和排出部位，采集不同的标本（表7-1）。例如流行性脑膜炎患者取脑脊液、血液或出血瘀斑；伤寒患者在病程第1～2周内取血液，第2～3周时可取粪便。尽可能采集病变明显部位的材料。
3．应在疾病早期和使用抗菌药物之前采集标本，否则可能需停药数天后采集，或者在分离培养时加入药物拮抗剂。
4．标本必须新鲜，采集后尽快送检，尤其是检测抵抗力弱的细菌。若不能立即送检，应将标本置于特殊的转运培养基中，低温保存，以减缓致病菌的死亡，阻止杂菌的过度生长。送检过程中，除不耐寒冷的脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等要保温外，多数菌可冷藏送运。
（二）致病菌的检验程序
主要有直接涂片染色镜检、分离培养、生化试验、血清学试验等，有的尚需作动物试验等。细菌学快速诊断新技术主要有核酸杂交（nucleic acid hybridization）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）等。敏感性、特异性和检测效率是影响临床诊断程序选择的重要因素。
1．直接涂片染色镜检 直接涂片染色镜检法可在显微镜下直接观察致病菌的形态、大小、排列方式和染色特点。凡在形态和染色性上具有特征的致病菌，直接涂片染色后镜检有助于初步诊断。例如痰中查见抗酸性细长杆菌，脑脊液或淤血点中查到肾形成双排列的革兰阴性球菌，脓液中发现革兰阳性葡萄串状球菌，或咽喉假膜中有异染颗粒的棒状杆菌时，可分别初步诊断为结核分枝杆菌、脑膜炎奈瑟菌、葡萄球菌或白喉棒状杆菌。此外，尿沉渣中发现优势菌类，或长期腹泻患者粪便中发现革兰阳性球菌和真菌等优势菌，均有重要的诊断价值。在某些情况下，也可在直接涂片后，以特异性荧光抗体染色，在荧光显微镜下观察，若出现有发荧光的菌体就是欲检验的细菌。例如粪便中的志贺菌、霍乱弧菌，以及呼吸道标本中的嗜肺军团菌和百日咳鲍特菌等可用此技术快速检出。
染色或不染色标本的形态学检查法较为简便、快速、价廉，为临床检验所常用，特别是有的细菌尚不易进行人工培养，或培养时周期较长，只能通过直接涂片染色并结合临床确诊。但是，直接涂片镜检法的敏感性不及分离培养法。
2．分离培养 有很多种类的细菌在形态、排列方式和染色性上不能区分，需进行细菌的分离培养，这是确诊细菌感染性疾病最可靠的方法（金标准），并有助于选用抗菌药物及评价疗效。由于各种细菌的生物学特性有所差异，所采用的培养基和培养方法也不尽相同。
从无菌部位采取的血液、脑脊液等标本，可直接接种至营养丰富的液体或固体培养基；从正常菌群存在部位采取的标本，应接种至选择或鉴别培养基。接种后置37℃孵育，一般需氧菌经16～20小时大多可形成菌落（colony），厌氧菌和微需氧菌通常需2～3天才形成菌落。少数菌如布氏菌、结核分枝杆菌生长缓慢，分别需培养3～4周和4～8周才长成可见菌落。根据细菌所需要的营养、生长条件、菌落特征可作初步鉴别，确诊还需对纯培养物进行形态特征、生化试验和血清学试验鉴定。分离培养法的阳性率要比直接涂片镜检高，但需时较久。因此，遇白喉、气性坏疽等急性传染病时，可根据患者临床表现和直接涂片镜检结果作出初步诊断并及时治疗，不必等待分离培养报告，以免贻误治疗时间。
3．生化试验 细菌的代谢活动依靠一系列酶的催化作用。不同细菌具有不同的酶系，对营养物质的分解能力及其代谢产物不尽相同。检测细菌对各种基质（如糖类和蛋白质）的代谢作用和代谢产物的差异，借以区别和鉴定细菌，称之为细菌的生化试验（biochemical testing）。例如幽门螺杆菌产生极强的尿素酶，可分解尿素产生氨，使培养液呈碱性，pH指示剂则改变颜色。生化试验对菌体形态、革兰染色反应和菌落特征相同或相似的细菌（如肠道杆菌）的鉴定尤为重要。
现代临床细菌学已普遍采用微量、快速、半自动化或自动化的细菌生化鉴定和细菌药敏分析系统，使细菌检出水平明显提高，所需时间大为缩短，推进了相关标本鉴定的准确性与时效性。其中，VITEK-AMS系统可鉴定细菌和真菌200～300多种及近100种不同抗菌药物的敏感性测试。细菌鉴定原理是根据不同细菌的理化性质不同，采用光电比色法，测定细菌分解底物导致pH改变而产生的不同颜色，来判断反应的结果。
4．血清学试验 在许多情况下，难以从患者的临床标本中分离出致病菌，特别是在发病早期已用抗生素等药物治疗过的患者，因致病菌的生长被抑制或杀死，可明显影响致病菌的检出率。但是，采用血清学试验（serological testing），即用含有已知的特异性抗体的免疫血清，可快速、准确地检出临床标本中极微量的致病菌特异抗原，亦可鉴定分离培养出的未知纯种细菌，并可确定致病菌的种或型，有助于确定病因。常用方法有凝集试验（如玻片凝集试验、协同凝集试验、乳胶凝集试验、反向间接血凝试验）、免疫荧光技术、酶联免疫吸附（ELISA）等。
5．动物试验 利用动物实验，可进行致病菌的分离与鉴定、细菌毒力的检测等。常用实验动物有小鼠、豚鼠和家兔等。应根据实验目的，选用一定体重或年龄的高度易感性的健康动物。接种途径有注射（皮内、皮下、腹腔、肌肉、静脉、脑内）和灌胃等。接种后应仔细观察动物的食量、精神状态和局部变化等。若动物出现特有的症状或死亡，应立即解剖，检查病变，或作细菌分离培养，证实由何种致病菌所致。动物实验一般不作为常规细菌学诊断。
6．基因诊断技术 核酸杂交和PCR技术不需分离培养，只需检测标本中致病菌的特异性核酸片段，即可鉴定出致病菌，具有特异性强、敏感度高、快速等特点，尤其适用于检测难以或不能培养的致病菌（如梅毒螺旋体），以及培养时间较长或培养条件苛刻的致病菌（如立克次体、衣原体、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、嗜肺军团菌和无芽胞厌氧菌等）。
（1）核酸杂交技术：原理是应用放射性核素或生物素、地高辛、辣根过氧化物酶、荧光素等非放射性物质标记的已知序列单链核酸（如16SrRNA编码基因中的保守序列）作为探针（probe），在一定条件下，根据碱基配对原则，与待测标本的同源或部分同源核酸单链退火，形成双链杂交体。然后，通过杂交信号的检测，鉴定临床标本（如血清、尿、粪便或活检组织）中有无相应的病原体特异基因。
核酸杂交过程可在溶液中进行（液相杂交），也可使探针DNA结合到固相载体（如硝酸纤维膜）上，或使组织中DNA双链打开，然后进行杂交（固相杂交）。固相核酸杂交较为常用，有原位杂交（in situ hybridization）、斑点杂交（dot blot）、Southern印迹、Northern印迹等。核酸杂交可直接检出标本中的致病菌，不受标本中的杂质干扰，对尚不能或难分离培养的致病菌尤为适用，亦可同时检出多种致病菌。
（2）PCR技术：是一种体外扩增特异性DNA片段的技术，具有快速、灵敏度高和特异性强等特点。其基本步骤是，从标本中提取DNA作为扩增模板，选用一对人工合成的特异寡核苷酸作为引物，在热稳定DNA聚合酶作用下，经不同温度的变性、退火、延伸，多次循环后，即可在数小时内获得数百万个特异性DNA序列的拷贝。扩增产物作琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色后，即可确定要扩增的目的DNA存在与否。若需进一步鉴定，可从凝胶中分离和回收PCR产物，再用标记的特异探针确定，或直接测序分析。目前，PCR技术和由此发展而来的逆转录PCR（reverse transcriptase PCR, RT-PCR）、定量实时荧光PCR（real-time PCR）等技术已广泛用于感染性疾病的基因诊断。
（3）DNA芯片（DNA array）技术：又称基因芯片（gene chip）技术，由核酸杂交技术衍生而来。其基本原理是：首先，将大量的特异寡核苷酸探针有序地、高密度地点布并固定在硅片、玻片等固相支持物上，组成DNA微点阵（microarray），即DNA芯片；然后，抽提待检样本中的DNA或mRNA，用荧光染料标记后，与DNA芯片上的探针杂交，应用激光共聚焦显微扫描技术，记录杂交结果；最后，应用分析软件，对杂交位点及其信号强弱进行分析，找出差异表达的基因，判别标本中的特异性致病菌。应用致病菌基因组、耐药基因、毒力基因等重要基因的芯片，通过单一杂交即可完成致病菌的基因分型与菌种鉴定、耐药性快速诊断、致病菌与非致病菌鉴定等，为临床治疗提供可靠的理论依据。该技术可将许多不同类型的探针同时固定于一张芯片上，一次可对样品中可能存在的多种致病菌进行系统检测分析。
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