一.实验目的： 

1. 了解温度对微生物生长的影响； 

2.了解渗透压对微生物的影响； 

3. 了解某一抗生素（链霉素）的抗菌范围，学习抗菌谱试验的基本方法。 

二.实验原理： 

1. 温度: 温度是影响微生物生长与存活的最重要因素。自然界的微生物可根据对温度的适应性分为低温型、中温型和高温型。但不管哪一种温度型的微生物，都有生长温度范围。分为最高、最适和最低生长温度。在最适宜温度里生长良好：超过最高温度细胞死亡；低于最低温度细胞被抑制或死亡。 

温度对微生物影响的实际应用：应用上利用高温进行杀菌；低温抑制微生物；最适温度培养微生物的活动。 

高温加热灭菌法有火焰灼烧；煮沸消毒；干热空气灭菌；高压蒸汽灭菌等。高温 

干热致死机理：主要由于细胞内蛋白质受热变性，蛋白质结构发生变化而凝固等。高温热致死的影响因素有致死温度、高温时间和微生物的耐热性能。一般情况下，病原微生物细胞最不耐热，而霉菌和放线菌的孢子、细菌芽孢最耐热。 

低温下多数微生物处于被抑制状态。病原菌和一些微生物在低温下也易死亡。其致死机理为细胞内外水份结成冰，冰晶对细胞造成损伤破坏作用。因此，应用上低温可以用来保存食品，和在有一定措施条件下进行保存菌种。

2.渗透压的影响：在等渗溶液中，（环境渗透压和细胞内渗透压相同或相近，细胞在等渗环境中生长好，如0.85％氯化钠——生理盐水），微生物正常生长。在高渗溶液（如高盐、高糖溶液中），细胞失水收缩，从而抑制了微生物体内的生理生化反应，抑制其生长繁殖。而在低渗溶液中，由于细胞壁的保护作用，微生物受低渗的影响不大。 

不同类型的微生物对渗透压变化的适应能力不尽相同，大多数微生物在0.5％3％的盐浓度范围内可正常生长，10～15％的盐浓度能抑制大部分微生物的生长，但对嗜盐细菌而言，在低于15％的盐浓度环境中不能生长，而某些极端嗜盐菌可在盐浓度高达30％的条件下生长良好。 

本实验选择了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为实验菌种，其中大肠杆菌耐高渗透压的能力较差，在3%以下的NaCl下能正常生长，以5%的NaCl下即受到抑制；金黄色葡萄球菌有较强的耐盐能力，它在10%的NaCl溶液中仍能正常生长，因此实验选择了0.85%、5%、15%的NaCl溶液浓度作为实验浓度。 

3. 抗生素的影响：抗生素是某些微生物在生长代谢过程中产生的能抑制或杀死其它微生物的次生代谢产物。每种抗生素都有它固定的抗菌范围和抗菌谱，例如青霉素只对革兰氏阳性菌具有抗菌作用，多粘菌素只对革兰氏阴性菌有作用，这类抗生素称为窄谱抗生素；另一些抗生素对多种细菌具有作用，例如四环素、土霉素对许多革兰氏阳性菌和阴性菌都有作用称为广谱抗生素。 

本实验选择了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为实验菌种，选择了链霉素作为实验抗生素。通过实验观察这种抗生素的抑菌范围。 

三. 实验用品：参考实验教材上的实验用品。 

四. 实验内容（三人一组）： 

1、每组分别倒制含有0.85%、5%、15%的NaCl浓度的肉膏蛋白胨培养基平板，于实验桌上静置待其凝固。其中含有0.85%NaCl浓度的倒制两块平板。【每组共四块平板，0.85％的2块、5%、15%的各一块】 

2. 从斜面上刮取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌分别放入10mL无菌水中，制备成菌悬液，于沸水浴中煮沸10min后备用。 

3. 取一块已经凝固的0.85％NaCl浓度的平板分成6等分，分别用接种环接种没有经沸水浴的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌斜面，和经过沸水浴的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌菌悬液；并在平板底相相应地标记好，于37℃倒置培养2天观察平板上的细菌生长情况。从而观察它们对温度敏感性的差异，思考产生这种差异的原因。 

4. 将已经凝固的5%、15%的NaCl浓度的肉膏蛋白胨培养基平板用记号笔分区划分为两等分，分别接种大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，并在平板底相相应地标记好，于37℃倒置培养2天观察平板上的细菌生长情况。从而观察它们对渗透压敏感性的差异。 

5. 用无菌镊子取无菌滤纸条一条，浸入链霉素溶液中，润湿，并在容器内壁沥去多余溶液，再将滤纸条贴在已经凝固的另一块0.85％NaCl浓度的平板上。 

   注意：滤纸条上含有的溶液不要太多，而且在贴滤纸条时不要在培养基上拖动滤纸条，避免抗生素溶液在培养基中扩散时分布不均匀。 

6. 无菌操作，用接种环，从滤纸条边缘分别垂直向外直线接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。于37℃倒置培养2天观察并记录平板上的细菌生长情况。

  注意：划线接种时要尽量靠近滤纸条，但不要接触，避免将滤纸条上的抗生素溶液与菌种混合。 

五.备注： 

引子：青霉素是抗菌素的一种，是从青霉菌培养液中提制的药物，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。　 

青霉素的发现者是英国细菌学家弗莱明。1928年的一天，弗莱明在他的一间简陋的实验室里研究导致人体发热的葡萄球菌。由于盖子没有盖好，他发觉培养细菌用的琼脂上附了一层青霉菌。这是从楼上的一位研究青霉菌的学者的窗口飘落进来的。使弗莱明感到惊讶的是，在青霉菌的近旁，葡萄球菌忽然不见了。这个偶然的发现深深吸引了他，他设法培养这种霉菌进行多次试验，证明青霉素可以在几小时内将葡萄球菌全部杀死。弗莱明据此发明了葡萄球菌的克星—青霉素。 

1929年，弗莱明发表了学术论文，报告了他的发现，但当时未引起重视，而且青霉素的提纯问题也还没有解决。 

　　1935年，英国牛津大学生物化学家钱恩和物理学家弗罗里对弗莱明的发现大感兴趣。钱恩负责青霉菌的培养和青霉素的分离、提纯和强化，使其抗菌力提高了几千倍同，弗罗里负责对动物观察试验。至此，青霉素的功效得到了证明。 

由于青霉素的发现和大量生产，拯救了千百万肺炎、脑膜炎、脓肿、败血症患者的生命，及时抢救了许多的伤病员。青霉素的出现，当时曾轰动世界。为了表彰这一造福人类的贡献，弗莱明、钱恩、弗罗里于1945年共同获得诺贝尔医学和生理学奖。 

   链霉素发明于1944年。是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素。它的抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。从此，结核杆菌肆虐人类生命几千年的历史得以有了遏制的希望。

1.物理因素对微生物的影响 

a.温度: 

b.干燥：干燥指没有水分或缺少水分的环境。微生物对干燥较为敏感。病原菌在干燥的环境下会较快死亡；一些微生物在长期干燥环境中缓慢死亡；部分抗干燥微生物仍能存在，但生命受到抑制。因此，干燥广泛应用于控制微生物，保存食品等。 

C.渗透压：指溶液中水分子由于渗透作用所产生的压力。 

等渗：环境渗透压和细胞内渗透压相同或相近，细胞在等渗环境中生长好。如0.85％氯化钠（生理盐水）就是等渗透压环境。 

高渗：环境渗透压高于细胞内渗透压。细胞脱水，严重时细胞质膜分离死亡。高渗透压环境可用于制造与保藏食品，如高盐和高糖食品不易变质就是这个道理。 

低渗：环境渗透压低于细胞内渗透压。细胞大量吸水而膨胀，甚至破裂死亡。  

d.超声波：指人耳朵听不见的声波。波长在9～20千赫/秒以上对微生物有破坏作用。超声波致死机理：振荡使细胞受到损伤，以及介质发热产生较高的温度对细胞的致死作用。超声波常用于提取细胞内的DNA、酶等进行遗传工程的分析。 

e.辐射：能量通过空间传递的电磁波。在射线中，有紫外线、r射线等。微生物对射线极为敏感。 

紫外线：波长比最短的可见光还要短，其杀菌波长在260nm时杀菌力最强。紫外线杀菌机理是细胞中DNA遭到破坏，形成胸腺嘧啶二聚体。紫外线杀菌特点：杀菌力强，穿透力弱，受伤的细胞具有光复活作用。应用上可作为空气及物体表面消毒杀菌，菌种育种等。 

x 射线、r射线等具有更强的致死作用。 

f.过滤除菌：硅藻土过滤器用于水体等液体过滤；棉花纤维过滤器用于发酵工业的空气过滤；超细玻璃纤维过滤器用于超洁净工作台空气的微生物过滤等。 

2.化学因素对微生物生命活动的影响 

化学物质浓度决定着影响作用：浓度合适是微生物的营养物；浓度高时成为抑制剂或成为杀菌剂。 

a.pH: 微生物生长在适宜的酸碱度环境中，如细菌、放线菌、藻类、原生动物等最适pH多为6.5～8.5（7.5左右）；酵母、霉菌最适pH多为4～6；少数微生物能在pH<2或pH>10环境中生长，这些微生物称为极端微生物。 

酸碱影响微生物生长的机理：细胞中DNA、ATP、蛋白质易遭到酸碱破坏，酸碱还影响细胞膜与酶蛋白的电荷，影响物质吸收和催化。 

酸碱在控制微生物上的应用：乳酸、醋酸、碱等可作为消毒剂。如石灰水（2％CaO3的水溶液）、NaOH、NaCO3等常作为厂房、环境等卫生的消毒剂。 

b.重金属盐类 

重金属离子对微生物有毒害作用。杀菌机理是与细胞蛋白质结合使之变性，或金属离子与酶SH基结合而使酶失去活性。 

HgCL2（升汞），浓度在1:500～1:2000对细菌杀菌作用强。但对金属有腐蚀作用，对人与动物有剧毒，因此少用。 

Ag盐：AgNO3是温和的杀菌剂，0.1～1％可用于消毒皮肤。 

Cu盐：CuSO4对真菌与藻类杀伤力强，供水系统常使用CuSO4 杀藻。 

c.     氧化剂 

指本身能放出游离氧或能使其它化合物放出氧的物质。氧化剂能导致微生物细胞物质氧化，代谢紊乱而死亡。 

高锰酸钾：0.1～0.3％用于清洁后的物体表面（皮肤、蔬菜及水果等）消毒。酸性下杀菌有效，碱性下产生MnO2沉淀（杀菌减弱）。需现配现用。 

Cl2、漂白粉、氯胺等含氯氧化剂，用于饮用水、厂房、工具等消毒。Cl2消毒剂量0.2～1ppm；漂白粉（次亚氯酸钙）Ca(OCl)2常用浓度为0.5～1.2％。实践中常以10％石灰水5份和5％漂白粉1份混合应用于环境、厂房等场地卫生的喷洒消毒。 

d.有机物（酚、醇、醛） 

酚类为强消毒杀菌剂。2～5％的苯酚（石碳酸）常作为实验室玻璃器具以及环境等卫生消毒杀菌。 

醇类杀菌随分子量增加杀菌效果提高。但分子量大的醇对人体有毒害作用，且不易与水结合。60～75％乙醇是常用消毒剂。碘＋乙醇（碘酒）杀菌效果更好。 

甲醛：纯甲醛是气体。35～40％甲醛水溶液为福尔马林。福尔马林杀死细菌与真菌效能强，是制作动物、植物标本的防腐剂。5％甲醛可以喷洒、熏蒸，用于空气、接种室等环境的消毒杀菌。 

e.表面活性剂：指具有降低表面张力效应的物质。如肥皂、新洁尔灭等都是皮肤良好的消毒剂。 

f.染料：染料也具有抑菌或杀菌作用。碱性染料杀菌能力强于带负电荷的酸性染料。 

g.氧化还原电位（E值）：近年来用于给排水工程的科学研究与指导废水处理的运转工作中。它反映了微生物生长代谢环境的氧化还原电位。好氧处理系统如氧不足，电位低，兼性或厌氧微生物则生长代谢，水体处理质量下降。

好氧微生物：   E值   +0.3～0.4V才能生长 

厌氧微生物：   E值  <+0.1V才能生长 

兼性厌氧微生物：E 值 >+0.1V进行好氧呼吸；E值<+0.1V进行厌氧呼吸。

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