一.实验目的：掌握微生物变异的原理，学习用梯度平板法分离抗药性突变株 

二.实验原理：基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用。 

基因中碱基顺序的改变可导致微生物细胞的遗传变异。这种变异有时能使细胞在有害的环境中存活下来，抗药性突变就是一个例子。微生物的抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是引发突变的诱导物。因而在含有一定抑制生长药物浓度的平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变的细胞会在平板上生成菌落。将这些菌落挑取纯化，进一步进行抗性试验，就可以得到所需要的抗药性菌株。抗药性突变常用作遗传标记，因而掌握分离抗药性突变株的方法是非常重要的。 

 为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变株常用梯度平板法。本实验用梯度平板法分离大肠杆菌抗链霉素突变株。 

三. 实验用品：参考实验教材上的实验用品。 

四.实验操作： 

（1）取一个已经灭菌的空平皿，把培养皿斜放(一边垫起)，在无菌条件下倒入不含药物的底层培养基（10mL LB培养基）； 

（2）待平板中的培养基凝固后将平皿放平，再倒入含有链霉素的上层培养基（10mL LB培养基，含有链霉素100μg/mL）； 

备注：这样便得到链霉素浓度从一边到另一边逐渐降低的梯度平板。 

（3）取一支大肠杆菌液体培养物，用移液管移取0.2mL菌液到梯度平板上，进行涂布。 

（5）将平板倒置于37℃培养2天；观察经一次培养的梯度平板上大肠杆菌的生长情况。 

（6）选择平板上1～2个生长在梯度平板中部的单个菌落，用无菌接种环接触单个菌落朝高药物浓度的方向划线。 

（7）将平板倒置于37℃培养2天；观察经二次培养的梯度平板上大肠杆菌的生长情况。  

五.注意事项： 

玻璃涂布棒在火焰上灼烧后要待其冷却后再进行涂布，以免烫死细胞；可以蘸上乙醇后在火焰上灼烧，以缩短冷却的时间。

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