2 结果与分析
2.1生长曲线
生长曲线实验每隔12h 取发酵液3 瓶，于600nm波长下测量 OD 值，绘制成曲线，结果见图1。
由图1可知，接种时培养液的 OD 值为 0.175，培养到12h 时OD值为1.78，细菌生物量增长了 9 倍多，到24 h 时 OD值为3.01，细菌生物量增长了16倍多，此期间细菌生物量的增加速度很快，生长属于对数生长期；培养时间在24 ~ 36 h 之间时，细菌生物量基本保持不变，为生长稳定期；培养36 h之后细菌开始死亡，细菌生物量随着时间推移逐渐减少，进入衰亡期。
2.2 培养时间对抗真菌素积累的影响
每隔12 h 取发酵液3 瓶，以 6000r/min 离心15 min，吸取上清液，进行抗真菌效果实验，结果见表1。由表1可以看出，刚接种的培养液在离心之后，尽管含有少量种子液，但其抗真菌素浓度太低，不足以抑制真菌生长，因此在平板上看不到抑菌圈；随着发酵时间的延长，抗真菌素不断累积，到48 h 时发酵液的抗菌活性最强，抑菌圈直径达12.8 mm；之后抗真菌素活性逐渐减小，到96 h 时抑菌圈直径仅为8.8 mm。由实验结果可知，供试菌株发酵生产抗真菌素的最佳时间为培养48 h。
2.3 装液量对抗真菌素积累的影响
在250 mL三角瓶中分别装入 25、50、100、150、200 mL发酵液，研究装液量对抗真菌素积累的影响，结果见表2。由表2 可知，在相同体积的三角瓶中，装液量较少时，其溶氧系数较高，枯草杆菌产生抗真菌素
也较多，其中装液量为50 mL 时，抗真菌素积累较多，抑菌圈直径达14 mm。说明装液量50 mL 对抗真菌素积累的影响最大。
2.5 不同碳源对抗真菌素积累的影响
以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、D-半乳糖和可溶性淀粉6种物质为实验碳源，质量浓度均为0.5%，研究不同碳源对抗真菌素积累的影响，结果见表4。由表4可知，枯草芽孢杆菌BS - 06 生产抗真菌素的最佳碳源为麦芽糖，抑菌圈直径达14.0 mm；其次为葡萄糖，抑菌圈直径为11.5 mm。
2.6 麦芽糖浓度对抗真菌素积累的影响
枯草芽孢杆菌BS - 06在麦芽糖质量浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%时，对发酵生产抗菌物质的影响结果见表5。由表5可知，发酵液的抗真菌活性在麦芽糖浓度为2%时最高，抑菌圈直径为14.6 mm。其他几种麦芽糖浓度处理的抗真菌素活性基本接近。
2.7 不同氮源对抗真菌素积累的影响
选用牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵和硝酸钾6种物质为实验氮源，牛肉膏、酵母膏、蛋白胨浓度为0.5%，硫酸铵、硝酸铵和硝酸钾的浓度为0.1%，考察它们对抗真菌素积累的影响，结果见表6。由表6可以看出，牛肉膏、酵母膏、蛋白胨和硝酸钾都可以被枯草芽孢杆菌BS - 06 利用，并能产生抗真菌素，其中硝酸钾为最佳氮源，抑菌圈直径可达12.2 mm，可能是K+能够提高抗真菌素的活性；硫酸铵、硝酸铵则对BS - 06产抗真菌素不利，可能是由于NH4+，抑制了抗真菌素的活性。
2.8 硝酸钾浓度对抗真菌素积累的影响
研究了枯草芽孢杆菌BS - 06在硝酸钾质量浓度分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%时，对发酵生产抗菌物质的影响，结果见表7。由表7可以看出，硝酸钾浓度在0.05% ~ 0.2%的范围内，抗菌物质的活性随硝酸钾浓度升高而增大，最大抑菌圈直径达15.5 mm；而硝酸钾浓度超过0.2%时，抗菌物质的活性则下降，抑菌圈直径仅仅为9.8 mm。
2.9 不同浓度吐温- 80对抗真菌素积累的影响
在培养基中添加不同浓度的非离子型表面活性剂吐温- 80，结果发现0.1%、1%、10% 3种浓度均能促进抗真菌素的活性，抑菌圈直径分别为14.3、15.8、14.3 mm，其中以1%的浓度最佳，抑菌圈直径比不添加吐温- 80的对照（12.2 mm）增加近30%。这可能是因为吐温80与枯草杆菌的细胞膜相互作用，增加了细胞膜的通透性，从而增加了抗真菌素向细胞外分泌的量。
2.10 抗真菌素的抗菌谱检验
在上述优化条件下，研究了抗真菌素对节瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌、稻瘟病菌的抗菌效果，结果5种致病菌的抑菌圈直径分别为18.0、19.3、15.3、11.3、11.5 mm。可见，枯草芽孢杆菌BS - 06发酵产生的抗真菌素除了对水稻纹枯病菌具有良好的抗菌性外，对其他4种真菌均有较强的抑菌作用，有望开发成为生物农药，应用于农作物的真菌病害防治。
3 结语
本研究通过一系列单因素实验，确定了枯草芽孢杆菌的最佳发酵条件为：培养时间48 h，装液量为50 mL，初始pH值为8.0，培养基中添加2%麦芽糖、
0.2%硝酸钾和1%吐温 - 80。枯草杆菌BS - 06产生的抗真菌素具有较广的抗菌谱，对水稻纹枯病菌、稻瘟病菌、节瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌均有较好的抗菌效果，有望开发成生物农药来防治农作物病原真菌。
本研究的后续研究工作拟对该抗真菌素进行分离纯化和结构鉴定，以及对其性质进行研究，以期为该抗真菌素在农作物真菌病害防治上的应用提供依据。
参考文献：
［1］ 余凤玉，李振华，曾会才.抗真菌农用抗生素的研究进展[J].热带农业科学，2005,25(1)：61-66.
［2］ 李巧丽，袁月星.抗植物真菌病害基因及其应用［J］" 生物学教学，2000,25(12) ：2-4
［3］ 蒋琳，马承铸.生物农药研究进展（综述）［J］.上海农业学报，2000,16（增刊）：73-77
［4］ 孔建，王文夕，赵白鸽，等.枯草芽孢杆菌B - 903菌株的研究Ⅱ.抗菌物质的理化特性［J］.中国生物防治，2000,16（1）：12-14.
上一篇：枯草芽孢杆菌培养生产农用抗真菌素初步研究（一）
下一篇：细胞培养无菌操作注意事项
