摘要 在烟碱生物降解的研究和实际应用中，需要在较短的时间内获得大量 0．intermedium DN2菌体。为了提高菌株DN2的菌体浓度，缩短其培养时间，本研究采用Plackett-Burman设计对影响O．intermedium DN2生长的内在和外在相关因素进行了评价。结果表明，影响菌株 DN2生长的显著因素有胰蛋白胨、MgSO4·7H2O、初始 pH值、温度、装液量和培养时间。在此基础上，采用响应曲面法分别对该菌生长培养基的组成和培养条件进行优化，得到最佳培养基组成为(g／L)：胰蛋白胨11.34、牛肉膏3.00、NaCl 5.00、MgSO4·7H2O 3.71，pH值7.23；最佳培养条件为温度32℃、转速120r／rain、装液量 88ml／250ml三角瓶、培养时间34h。5L发酵罐验证实验表明，菌株 DN2达到最大生长量的时间为36h，与预测值34h基本一致，比优化前缩短约12h；最大菌体浓度为6.49×10⁹cfu／ml，与预测值6.73×10⁹cfu／ml接近，比优化前高近一个数量级。

关键词 O．intermedium DN2 培养基组成培养条件 Plackett-Burman设计  响应曲面法

烟碱是普通烟草中的生物碱，俗称尼古丁(nicotine)。烟碱既是成瘾物质也是有毒物质。成人一次摄入40～60mg尼古丁，就可能致命。在烟叶和烟草制品的生产过程中会产生大量的固体、液体和气体废弃物，其中烟碱的平均含量高达 18g烟碱／kg干重。在欧洲，当每kg烟草废弃物(干重)中烟碱含量超过500mg时，就被归类为“有毒和有害物质”。1994年以来，美国一直把烟碱列在美国排放毒性化学品目录(Toxics Release Inventory，TRI)中。据报道，我国每年产生的烟草废弃物约100万吨。这些废弃物如果不加处理就投放到环境中，会破坏生态环境，危害人类健康。目前，国外研究者已从环境中分离了多种烟碱降解菌，而国内在这方面的研究较少。实践证明，生物降解法是去除或减少烟草废弃物中烟碱的有效途径。

本实验室从土壤中分离到一株新的烟碱降解细菌，鉴定为Ochrobactrum intermedium DN2 13,14]。学者们对0．intermedium的认识较晚，Velasco等在 1998年才首次描述了其特征。目前培养该菌主要是用 LB培养基，但菌株 DN2从斜面培养基接种到普通的牛肉膏蛋白胨培养基中，迟滞期长，菌体含量较低。这不仅降低研究效率，也会使生产成本增加，不利于将来的大规模应用。为缩短制备种子液的时间，提高种子液中菌体的浓度，本研究分两阶段分别采用 Plackett—Burman筛选实验和响应曲面法(response surface methodology，RSM)对该菌生长的培养基及培养条件进行优化。

Plackett—Burman设计法是基于不完全平衡块原理，能从众多变量间快速有效地筛选出最为重要的因素。响应曲面法是综合实验设计和数学建模，通过局部实验回归拟合因素与结果间的全局函数关系，同时对影响生物产量的各因子水平及其交互作用进行优化与评价。与传统优化方法相比，RSM所需的实验组数相对较少，可节省人力、物力。该法已经广泛地应用于各类培养基以及发酵条件的优化。

1 材料与方法

1.1 材料                 

1.1.1  供试菌株 0．intermedium DN2，本实验室从土

壤中分离得到。

1.1.2 培养基  种子培养基(g／L)：牛肉膏3.0、蛋白胨 10.0、NaCl 5.0，pH值 7.0；斜面培养基：种子培养基添加2.0％琼脂，斜面-4℃冰箱保存；活菌计数培养基：同斜面培养基；Plackett-Burman实验培养基：按照实验设计配制；旋转中心组合设计 (central composite rotable design，CCRD)实验培养基：以不加蛋白胨的种子培养基为基础，按照实验设计添加胰蛋白胨和MgSO4·7H20配制不同初始 pH值的培养基；Box-Behnken实验培养基：CCRD优化后的培养基。

1.2 方法

1.2.1  培养条件和方法  从新鲜斜面上取一环菌体接入种子培养基，30℃，120r／min摇床培养 48h，制得种子液(菌体浓度为 7.06×10 cfu／ml)。以 1％接种量(v／v)接入各培养基中，其它条件依据不同的试验要求具体确定。CCRD的培养条件：装液量为 100ml／250m1三角瓶，30℃，120r／min摇床培养24h。

1.2.2 菌体浓度的测定 平板涂布法 ：将培养液适当稀释，吸取 lml稀释液涂布于活菌计数平板上。37％恒温培养 48h后，进行菌落计数。结果以 lg cfu／ml报告菌体浓度。

1.2.3 实验设计 (1)Plackett-Burman实验设计：依据前期的实验结果以及细菌生长所需营养要素的基本原则和影响细菌生长的主要外界条件，选取 15种相关的内在和外在因素为考察对象。它们的取值范围分别为：葡萄糖2.O0～5.O0g／L、蔗糖 2.00～5.00g／L、胰蛋白胨2.50～5.O0g／L、蛋白胨 2.50～5.00g／L、酵母膏1.00～2.00g／L、NH4NO3 1.O0～2.00g/L、NaCl 1.O0～3.O0g／L、MgSO4·7H2O 0.50 —1.00g／L、FeSO4·5H2O 0.01～0.03g／L、KH2PO4 1.00～3.00g／L、温度 30～35℃、转速120～180r／rain、装液量50.0～100.0ml、初始 pH值6.0～7.0以及培养时间10～14h。设 2个重复，以菌体浓度平均值为响应值。本试验设计、数据分析及模型建立由JMP软件(version4.0.5，SAS Institute)辅助完成。实验设计方案略。(2)RSM实验设计：基于 Plackett-Burman试验结果，采用 CCRD设计对影响菌株 DN2生长的关键内在因素进行研究和探索，以获得影响该菌生长的最佳培养基组成及其浓度水平范围。采用 Box-Behnken设计对影响该菌生长的关键外在因素进行研究。设 2个重复，以菌体浓度平均值为响应值。实验因素水平及其编码见表 1。实验辅助软件为 Design Expert(version 6.0.5，Stat-Ease Inc．，Mninneapolis，MN，USA)。

表 1  实验因素水平及其编码表

A:x1=(X1-10)/5; x2=(X2-4)/2; x3=(X3-7.25)/1.25; x4=(X4-31)/6;x5=(X5-60)/40;x6=(X6-20)/4

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