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从大规模裂解物中制备λ噬菌体颗粒



录入时间:2011-9-23 16:26:18 来源:生物在线

一、材料:
1、缓冲液和溶液:
氯仿
NaCl(固体)
聚乙二醇(PEG 8000)
SM
2、酶和缓冲液:
胰Dnase I (1mg/ml)
胰Dnase I (1mg/ml)于TE中(ph7.6)
3、离心机和转子:
Sorvall  GSA 转子或相当型号
4、专用设备:
量筒(2L)
载体和菌株:
大肠杆菌培养物,经λ噬菌体感染和裂解
二、方法:
用PEG沉淀噬菌体颗粒
1、  将含有λ噬菌体的裂解培养物冷却至室温,加胰Dnase I和Dnase 至终浓度约为1ug/ml,室温温育30min。
2、  每500ml培养物加入29.2固体NaCl(终浓度为1mon/L),搅拌使其溶解。将培养物冰浴1h。
3、  4℃,11000g(8300r/min于Sorvall GSA转子中)离心10min以去除细胞碎片,将四份培养物的上清混合置于2L的干净量筒中。
4、  测定所收集上清的总体积,然后转移至2L的烧瓶中,加固体PEG至终浓度为10%(m/V,加500ml上清加50gPEG),于室温用磁力搅拌器慢慢搅拌溶解PEG。
5、  将噬菌体/PEG溶液转移至聚丙烯离心管中,于冰水浴冷却,至少放置1h以便使噬菌体颗粒发生沉淀。
6、  4℃,11000g(8300r/min于Sorvall GSA转子中)离心10min以回收沉淀的噬菌体,去上清,将离心管倒过来倾斜放置5min,以便是剩余液体充分流干。用移液器吸取残余的液体。
用氯仿抽提细菌碎片:
7、  用一带橡皮球的宽口吸干将噬菌体沉淀轻轻地重悬于SM中(针对步骤3每500ml上清加8ml SM),将离心管倾斜放置,使SM完全覆盖并浸泡噬菌体沉淀,室温放置1h。
通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬浮液中的PEG和细胞碎片,温和振荡30s。4℃,3000g(4300r/min于Sorvall GSA转子中)离心15min以分离有机相和亲水相,回收含噬菌体颗粒的亲水相。

 

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