1  材  料

    1.1  培养基及试药 

    营养琼脂培养基（批号：071008）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：070329）、改良马丁培养基（批号：061020）、改良马丁琼脂培养基（批号：060404）、胆盐乳糖培养基（批号：060913）、营养肉汤培养基（批号：061113）、MUG培养基（批号：060913）、 分析纯氯化钠(批号：070725)试剂。 

    1.2  菌  种 

    大肠埃希菌［CMCC(B)44102］、金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、白色念珠菌［CMCC(B)98001］、黑曲霉［CMCC(B)98003］，均由江苏省药检所提供。 

    1.3  主要仪器设备 

    HHB11360型电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；DG2型多功能恒温箱（上海医疗器械厂）；ZF7C型三用紫外分析仪（上海慧鑫科学仪器有限公司）；YXQ LS75SⅡ型全自动立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；1013A鼓风干燥箱（通州市沪通制药机械设备厂）；HTY-2000A集菌仪（杭州泰林医疗器械厂）；800型离心沉淀器（江苏江阴科研器械厂）。 

    1.4  样  品 

    头孢拉定胶囊，规格：0.25 g，批号：071003， 071113， 071201。生产单位：江苏聚荣制药集团有限公司。 

    2  方  法 

    2.1  细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证［1］ 

    2.1.1  供试液制备  取供试品10 g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml，于45℃水浴中保温、浸泡、振摇溶化，制成1∶10的供试液。 

    2.1.2  菌液的制备  (1) 将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物1白金耳分别接种至10 ml营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24 h，分别取上述培养物1 ml加入9 ml 0.9％的无菌氯化钠溶液内以10倍递增稀释制成每1 ml含菌数 50～100  cfu的菌悬液。(2) 将白色念珠菌的新鲜培养物1白金耳接种至10 ml 改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48 h，取上述培养物1 ml加入9 ml 0.9％的无菌氯化钠溶液内以10倍递增稀释制成每ml含菌数50～100 cfu的菌悬液。(3)将黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7 d，使大量孢子产生。加入0.9％无菌氯化钠溶液5 ml,用无菌玻棒轻轻将孢子洗脱，然后用一支管口包有无菌棉花且能过滤菌丝的10 ml吸管吸出孢子液至无菌试管内，用0.9％的无菌氯化钠溶液稀释再与标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，再逐步稀释制成每ml含孢子数 50～100 cfu的孢子悬液。 

    2.1.3  验证方法  本品对细菌生长有强抑制作用，药典所规定的三株验证实验用菌株：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌对本品均较为敏感，所以本品的细菌数测定应采用薄膜过滤法。本品为胶囊剂，由于囊壳中的明胶使供试液在常温下易成凝胶状，而造成取样困难，滤膜堵塞，所以应注意操作全过程保持45℃。本制剂中含有一定量的不溶性辅料，宜采用低速离心-薄膜过滤联合应用。由于本品对真菌没有抑制作用，进行霉菌及酵母菌计数无需采用薄膜过滤法，使用常规法（平皿法）即可使白色念珠菌和黑曲霉的回收率达到要求。 

    2.1.3.1 细菌计数方法的验证（低速离心-薄膜过滤联合应用）  （1）供试液的制备。取1∶10的供试液10 ml注入离心管中，500 r/min，离心5 min。取上清液置另一离心管中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至10 ml。（2）试验组：用少量的稀释剂将薄膜过滤器内的滤膜湿润。取低速离心后制备的供试液1  ml加于pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml中过滤，再用400 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，泵速为160转，冲洗3次后将含50～100 cfu／ml大肠埃希菌的菌悬液1  ml加入剩余的100  ml冲洗液中过滤。取出滤膜菌面朝上，贴于含2  ml β内酰胺酶营养琼脂培养基平板上，30～35℃培养48 h。对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的验证同法操作。（3）菌液组：分别取上述稀释的三株验证用菌的菌悬液各1 ml，按照平皿菌落计数法测定其试验菌数。（4）供试品对照组：按“2.1.3.1”（2）法（不加试验菌）操作测定供试品的本底菌数。（5）稀释剂对照组：按“2.1.3.1”（2）法（用稀释剂代替供试品）操作对稀释剂进行验证。 

    2.1.3.2  霉菌及酵母菌计数方法的验证（平皿法）  （1）试验组：取1∶10的供试液1 ml分别加入4个平皿内，再依次加入白色念珠菌、黑曲霉菌悬液1 ml（50～100 cfu／ml），每株菌平行制备2个平皿，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，23～28℃培养72 h。（2）菌液组：分别取上述两株稀释的菌悬液各1 ml，注入平皿内，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每个菌平行制备2个平皿，以测定所加的试验菌数。（3）供试品对照组：取1∶10的供试液1 ml，注入2个平皿内，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，以测定供试品的本底菌数。（4）稀释剂对照组：本品未用特殊方法处理和制备。 

    上述方法独立平行实验3次。 

    2.1.3.3  头孢拉定胶囊菌落计数回收率测定实验结果  头孢拉定胶囊细菌计数采用低速离心-薄膜过滤联合应用，3次平行试验中均可使本品中所污染的三株验证（细菌）用菌的回收率达70％以上，说明用本法测定细菌计数结果是正确的。而采用平皿菌数计数法，3次平行试验中的两株验证（真菌）用菌的回收率均达70％以上，说明该法可用于霉菌及酵母菌计数。实验结果见表1。表1  头孢拉定胶囊菌落计数回收率测定实验结果 

    2.2  控制菌检查方法的验证 

    2.2.1  供试液的制备（同菌落计数方法验证） 

    2.2.2  菌液制备  分别挑取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物1白金耳，各接种至10 ml营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24 h，取摇匀培养物1 ml，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释制成每ml含菌数50～100 cfu的菌悬液。

2.2.3  大肠埃希菌检验方法的验证 

    2.2.3.1  试验组  取1∶10供试液10 ml经低速离心后制备的供试液（上清液），参照细菌计数测定方法进行薄膜过滤处理，转膜至含2 ml β内酰胺酶100 ml胆盐乳糖增菌液内，加入含86 cfu／ml的大肠埃希菌菌液1 ml，35～37℃培养18～24 h，可见培养基浑浊，有气体产生。取上述培养液0.2 ml接种至5 ml MUG培养基的试管内，培养5，24 h，在366 nm紫外线下观察，可见蓝白色荧光，滴加靛基质试液，液面呈玫瑰红色。 

    2.2.3.2  阴性菌对照组  取1∶10供试液10 ml，按“２.2.3.1”方法操作，加入含菌数75 cfu／ml金黄色葡萄球菌菌液1 ml，35～37℃培养18～24 h，培养基无浑浊，无气体产生。取上述培养液0.2 ml接种至5 ml MUG培养基的试管内，培养5，24 h，在366 nm紫外线下观察，无蓝白色荧光，滴加靛基质试液，液面呈试剂本色。 

    2.2.3.3 验证结果  试验组检出了大肠埃希菌，阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌，说明头孢拉定胶囊经低速离心-薄膜过滤联合应用处理后可以消除本品对大肠埃希菌的抑制作用。100 ml胆盐乳糖增菌培养基可用于本品的大肠埃希菌的检查。 

    3  结  论 

    头孢拉定胶囊细菌数测定可采取低速离心-薄膜过滤联合应用的方法进行；霉菌及酵母菌数测定可用平皿菌落计数法检验；大肠埃希菌检查时，可取1∶10供试液10 ml，用低速离心-薄膜过滤联合应用处理后，加入含2 ml β内酰胺酶的100 ml胆盐乳糖增菌培养基进行增菌培养，依法进行检查。 

    4  讨  论 

    根据《中国药典》微生物限度检查方法之规定，含抑菌成分的制剂，必须消除供试液的抑菌活性，然后再进行微生物限度检查。通过实验，我们认为： 

    (1)本品对细菌生长有强抑制作用，药典所规定的三株实验菌对本品均较为敏感，所以本品的验证必须采用薄膜过滤法。 

    (2)由于本品辅料的影响，容易造成滤膜堵塞，应首先经过低速离心（500 r/min离心5 min）去除辅料，取上清液经100 ml冲洗液进一步稀释，才能较顺利地通过滤膜。 

    (3)验证实验表明，本品按照一般薄膜过滤法处理仍然难以去除头孢拉定的抑菌活性成分，三株细菌的回收率往往达不到要求。本实验参照青霉素类系列产品无菌检查中添加β内酰胺酶加入胆盐乳糖增菌培养基中的方法，三株验证菌的回收率均符合要求。 

    (4)制备含β内酰胺酶营养琼脂平板时应注意控制实验温度于(45±1)℃，实验温度过高会造成酶蛋白失活而影响实验的准确性。 

（5）由于本品对真菌没有抑制作用，验证实验中，采用常规法（平皿法）测定即可使真菌类的两种实验用菌回收率均符合要求。 

作者：樊宝才 张丽珍   

【参考文献】

  ［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.2部.北京：化学工业出版社,2005:附录94-96. 

［2］ 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范［M］.北京：中国医药科技出版社，2005：330.

上一篇：微生物限度检查验证试验

下一篇：康腹止泻片微生物限度检查法验证