【摘要】 目的 建立硫酸庆大霉素颗粒效价的测定方法。 方法 采用比浊法和管碟法对硫酸庆大霉素颗粒的效价测定进行比较,并对比浊法进行方法学验证。结果 用比浊法测定硫酸庆大霉素颗粒效价,浓度的对数与吸收度成良好的线性关系,回收率良好;用比浊法测定与管碟法测定的结果无明显差异,方法学验证说明浊度法测定可行。结论 微生物浊度法测定硫酸庆大霉素颗粒效价的方法可行,且快速、简便。
【关键词】 微生物效价测定; 浊度法; 管碟法; 硫酸庆大霉素颗粒
硫酸庆大霉素是氨基糖苷类抗生素,由多个组分组成,其抗菌机理主要是阻碍细菌蛋白质的合成而杀菌,也是现在使用较为广泛的抗生素。由于硫酸庆大霉素组分较多,用化学检测方法还不能完全体现其抗菌能力,所以效价测定在控制其质量方面还不可替代。现在常用的效价测量方法还普遍是二剂量管碟法,但是管碟法也有其缺点[1],如检测时间过长,参数不稳定,受外界干扰较大等。2005年中国药典收载了比浊法测定抗生素效价的方法[2,3],但在实际检验中应用尚少,由于颗粒剂含有大量辅料,测定时更应考虑到相关辅料的影响。本研究参考了硫酸庆大霉素原料及片剂的浊度法测定方法[46],对用浊度法硫酸庆大霉素颗粒剂效价进行了研究,现将具体的试验内容报告如下。
1 仪器与试药
CZB1抗生素光度测量仪(北京潮声弘业科技有限公司);ZY300IV多功能微生物自动测量分析仪(北京先驱威锋技术开发公司);岛津UV2450分光光度计;BP211D电子天平(Sartorius,瑞士)。试验中所用的比色皿,培养基等均在115℃灭菌30 min.庆大霉素标准品(中国药品生物制品检定所,批号:130326200314,效价:638 u/mg);金黄色葡萄球菌 [CMCC(B)26003](中国药品生物制品检定所);抗生素检定培养基Ⅲ(北京三药科技开发公司);营养肉汤培养基(北京三药科技开发公司);硫酸庆大霉素颗粒A(A厂家,规格40 mg/包,批号:070502,070503);硫酸庆大霉素颗粒B(B厂家,规格10 mg/包,批号:080403,080404)。
2 实验方法
2.1 菌悬液的制备和含菌培养基的制备取金黄色葡萄球菌斜面培养物,接种于50 ml营养肉汤培养基中,置35～37℃培养约18 h,临用前以营养肉汤培养基为空白在550 nm的波长处测定其吸收度,调整菌液浓度使吸收度为1.0.在抗生素检定培养基Ⅲ中,加入上述实验菌液,加入量为1%(每100 ml中加实验菌液1 ml),摇匀,立即使用。并以未加菌的抗生素检定培养基Ⅲ为阴性空白。
2.2 线性范围及线性关系取庆大霉素标准品适量,精密称定,用灭菌磷酸盐缓冲液(pH7.8)制成100 u/ml的溶液,再稀释制成 1.0、0.8、0.64、0.52、0.41 u/ml溶液,作为线性实验标准溶液[5]。取上述标准品溶液各1.0 ml,置仪器配备的比色管中,再分别加入含菌培养基9.0 ml,摇匀,密塞,放入CZB1抗生素光度测量仪培养。以不含菌液培养基9.0 ml和1.0 ml无菌水作阴性空白,以含菌液培养基9.0 ml和1.0 ml无菌水作阳性空白。培养温度37℃,测定波长为530 nm.试验设定的5个浓度的标准品溶液剂间比为1∶1.25,从0.4 u/ ml～1.0 u/ ml,吸收度大概在0.2～0.6之间,相邻剂量间的吸收度差约为0.07,有较明显的剂间差。以浓度(C,u/ ml)的对数为横坐标X,吸收度(A)为纵坐标Y进行线性回归,显示线性关系良好,线性方程为:Y=289.380-869.151 X,r=0.999 0.庆大霉素的浓度剂量为1.0 u/ ml和0.5 u/ ml时,吸收度约为0.3～0.6,选取这两个浓度作为二剂量测定时的抗生素浓度,高低剂量比为2∶1.
2.3 回收率考察精密称取庆大霉素标准品适量,用灭菌水制成1 000 u/ ml的标准品溶液。精密量取适量,用灭菌磷酸盐缓冲液(pH7.8)分别稀释制成浓度为1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的标准品溶液;分别取相当于标示量的85%、100%、115%庆大霉素标准品,按硫酸庆大霉素颗粒处方中庆大霉素与辅料的比例分别加入相应剂量的辅料,同法稀释制成浓度为1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的溶液。分别精密量取上述溶液1.0 ml,置灭菌比色管中,每种溶液各6管,照2.2所述方法测定。回收率在99.3%～101.1%之间,平均回收率100.3%,回收良好，结果见表1.表1 硫酸庆大霉素回收率试验结果
2.4 重复性试验分别取相当于标示量85%、100%、115%庆大霉素标准品适量,按照硫酸庆大霉素处方中庆大霉素与辅料的比例分别加入相应剂量的辅料,同法稀释制成浓度为1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的溶液,用二剂量法分别测定含量3次,其RSD分别为1.6%,1.0%和1.2%.
2.5 辅料的影响取空白辅料,按照硫酸庆大霉素颗粒中辅料的量配制不含主药的空白溶液,照上述方法测定,其生长曲线和阳性对照完全一致,没有抑菌作用,说明空白辅料对实验无干扰。
2.6 浊度法和管碟法测定结果的比较取庆大霉素标准品及样品适量,精密称定,用灭菌水制成1 000 u/ ml的标准品溶液,精密量取适量,用灭菌磷酸盐缓冲液(pH7.8)分别稀释制成浓度为1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的溶液,高低剂量的剂间比为2:1.分别精密量取上述溶液1.0 ml,置灭菌比色管中,每种溶液各6管,分别加入含菌培养基9.0 ml,摇匀,密塞,放入CZB1抗生素光度测量仪培养3～4 h.阴性对照:磷酸盐缓冲液(pH7.8)1 ml,加9.0 ml未接种实验菌的培养基。分别用管碟法和浊度法的二剂量法对4批硫酸庆大霉素颗粒样品进行含量测定,对4批样品用管碟法和浊度法测得的含量基本一致,可信限FL(%)浊度法更佳,两种方法无显著差异,结果见表2.表2 浊度法与管碟法测定硫酸庆大霉素结果比较
3 讨论
3.1 试验菌液的制备和对试验的影响浊度法测定效价试验中,试验菌液的制备和质量是影响实验的重要因素。制备试验用菌液有不同的方法[710],采用斜面接种试验菌后再用灭菌水洗下菌体制备菌液也可用于试验,但是由于接种量难以控制,后期调整菌液浓度操作会更加繁琐,而采用这种液体培养基培养菌液的方法更加简便,更容易控制菌液的浓度,同时解决了从斜面培养基上直接洗下菌体制成的菌悬液菌体不均匀的问题。
3.2 浊度法测定的注意事项用浊度法测定时,培养时间一般为3～4 h,但最主要的还是要观察培养皿内的菌液生长情况,以菌液的吸收度在0.3～0.7的范围内的时间为最佳,而且高低浓度之间的吸收度差值应大于0.1,这样才能获得较好的结果。
3.3 辅料量对试验的影响采用管碟法测定硫酸庆大霉素颗粒效价时,发现由于颗粒剂辅料量很大,对试验结果有一定的影响,而采用浊度法测定时,由于测定浓度很低,样品溶液中辅料的浓度相应也减少很多,对试验基本无干扰。
3.4 浊度法测定效价的优势浊度法较管碟法测定效价更加简便、快捷,管碟法培养时间长,一般要16～18 h,要第2 d才能有结果,而浊度法试验当天便可有试验结果;同时,浊度法更少了手工制备双碟的步骤,减少了人为的误差,试验结果中可信限(FL%)大大提高。
【参考文献】
[1] 黄镜娟.管碟法测定抗生素效价结果的影响因素分析[J].现代医药卫生,2006,22(18):2853.
[2] 国家药典委员会.中国药典(二部)[M].北京：化学工业出版社，2005:附录79.
[3] 杨亚莉,胡昌勤.中国药典2005年版微生物检定法的增修订情况及要点[J].中国抗生素杂志,2005,30(12):721.
[4] 霍启录,邵红霞.微生物比浊法与管碟法测定硫酸庆大霉素效价的评价[J].中国药房,2000,11(1):37.
[5] 田光彩.标准曲线法测定硫酸庆大霉素片的抗生素效价[J].中国药业,2007,16(15):33.
[6] 毛影.硫酸庆大霉素生物检定结果准确度探讨[J].畜牧市场,2008,21(3):50.
[7] 范彬,杨雁莉,康勇.微生物浊度法测定吉他霉素的效价[J].药物分析杂志,2008,28(7):1114.
[8] 郭钫,蔡美明.微生物浊度法测定红霉素及其制剂的效价[J].药学与临床研究,2007,15(4):326.
[9] 霍天凤,赵素珍,宋闫军.微生物浊度法测定乙酰螺旋霉素的效价[J].医药论坛杂志,2006,27(20):37.
[10] 李正群,姜红.比浊法测定氯霉素注射液含量[J].中国药师,2002,5(10):611.
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