【关键词】 滋阴明目丸；微生物限度检查；验证试验
滋阴明目丸是由熟地黄、黄精、枸杞子、山药、当归、川芎等17味中药组方而成的复方制剂。对其进行微生物限度检查时,按照规定[1],必须进行方法验证试验,为此本试验对滋阴明目丸微生物限度的具体检查方法进行了验证,现总结现报道如下。
1 仪器与试药
Q/YYX1030-82型电热手提式压力灭菌器；101-2s电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；DHP781型恒温培养箱(湖北省黄石市医疗器械厂)；SPX-250C型恒温恒湿培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；SPX-103型净化工作台(安徽蚌净化设备厂)；漩涡混合器(江苏海门麒麟医用仪器厂)；CSY-Ⅱ型不锈钢电热恒温水浴锅(北京医疗设备厂)。
菌种：大肠埃希菌[CMCC(B)44102]；金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；枯草芽孢杆菌 [CMCC(B)63501]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲霉菌[CMCC(F)98003]。
营养琼脂培养基(中国药品生物制品检定所,批号20050103)；玫瑰红钠琼脂培养基(中国药品生物制品检定所,批号20061109)；胆盐乳糖增菌培养基(中国药品生物制品检定所,批号20070106)；改良马丁琼脂培养基(中国药品生物制品检定所,批号20060915)；MUG快检试剂(中国药品生物制品检定所,批号20061211)；蛋白胨(上海中洋生物公司东海药厂,批号060512)。其他试剂均为分析纯。pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液,照2005年版《中华人民共和国药典》(一部)配制。
试验样品：滋阴明目丸(本院自制,批号070305、070419、070821)。
2 实验方法与结果
2.1 菌液制备
取经37 ℃培养18～24 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌3种菌种,分别接种于10 mL营养肉汤中,置37 ℃培养箱中接着18～24 h,用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释至1O-5～1O-7约为5O～100 cfu,备用。
取白色念珠菌接种于10 mL改良马丁培养基中,置23～28 ℃培养18～24 h,用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释至1O-5～1O-7约为5O～100 cfu,备用。
取经23～28 ℃培养1周的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物,加0.9%无菌氯化钠溶液3～5 mL,将孢子洗脱,用管口带有薄无菌棉花的无菌毛细吸管吸出孢子悬液,置无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释为1 mL含孢子数5O～100 cfu的孢子悬液,备用。
2.2 供试液的制备
各取2个最小包装共10 g供试品(批号060402),加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL,振摇,使分散均匀,作为1∶10的供试液。
2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证
试验组：取供试液1 mL和5O～100 cfu试验菌,分别注入平皿中,每株菌平行制备2个平皿。菌液组：测定所加的试验菌数。供试品对照组：取供试液注入平皿中,测定供试品本底菌数。稀释剂对照组：取稀释剂和5O～100 cfu试验菌,分别注入平皿中,测定每株平行制备2个平皿。结果见表1。表1 回收率测定结果（略）
表1结果表明,3次平行试验,滋阴明目丸5株菌的回收率均大于7O%,表明滋阴明目丸按常规法进行细菌、霉菌及酵母菌计数,经方法学验证试验成立。
2.4 大肠菌群的验证试验
试验组：取1∶10、1∶100的供试液1 mL,分别接入10 mL胆盐乳糖发酵培养基中,分别加入大肠埃希菌混悬液1 mL, 30～35 ℃培养24 h,观察结果。阴性对照组：除菌液为金黄色葡萄球菌1 mL,方法同试验组。阳性对照组：除不加供试液,其他操作同试验组。结果见表2。表2 大肠菌群验证试验结果（略）
2.5 控制菌验证试验
试验组：取批号为060402的1∶10供试液10 mL,加入大肠埃希菌液1 mL,接入100 mL胆盐乳糖培养基中,35 ℃培养24 h；取上述培养物0.2 mL,接种至5 mL MUG培养基的试管中,35 ℃培养24 h；观察后,沿管壁加入数滴靛基质试液,观察结果。阴性菌对照组：除菌液为金黄色葡萄球菌1 mL,方法同试验组。阳性对照组：除不加供试液,其他操作同试验组。结果见表3。表3 大肠埃希菌验证试验结果（略）
滋阴明目丸3次平行试验,试验组都检出大肠埃希菌,阴性菌对照组都未检出金黄色葡萄球菌,表明滋阴明目丸的控制菌检查方法按常规法,经方法学验证试验成立。
2.6 样品检验结果
取滋阴明目丸3批供试品(070305、070419、070821)稀释液按常规法进行细菌、霉菌及酵母菌计数、控制菌检查,经检验符合规定。
3 结论
通过方法学验证试验得出：滋阴明目丸可按常规法进行微生物限度检查；进行霉菌及酵母菌计数和控制菌检查,按培养基稀释法(0.2 mL/皿)进行细菌计数。
4 讨论
由于中成药是含有多种成分的复合制剂,作用机理并不十分明确,其中任何成分具有抑菌作用均可影响微生物限度检查的准确性。因此,在研究滋阴明目丸微生物检查方法时,以2005年版《中华人民共和国药典》作为依据,并参考文献[2-3]将5种阳性对照菌的回收率作为评价所采用的方法是否适合于本品种。
采用常规法检查滋阴明目丸的细菌、霉菌及酵母菌,回收率显示,本品对大肠埃希菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉均无抑制性。采用常规法检查滋阴明目丸的控制菌,结果符合药典规定。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.附录70.
[2] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京：中国医药科技出版社,2005.326－328.
[3] 马绪荣,苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京：科学出版社,2000.65.
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