【摘要】  目的：建立一种龙胆泻肝丸微生物限度检查方法。方法：采用药典规定的常规法和稀释法，通过验证确认所采用的方法是否适合于*该药品的细菌、霉菌和酵母菌、控制菌的检查。结果：细菌、霉菌和酵母菌方法验证中回收率在70%以上;控制菌方法验证中阳性对照菌检出，阴性对照菌未检出。结论：龙胆泻肝丸微生物限度检查法的细菌、霉菌和酵母菌数可以采用常规法或稀释法进行检查，控制菌检查可以采用常规法检查。

【关键词】  微生物限度; 验证

当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

　　1 实验材料

　　1.1 培养基

　　营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、胆盐乳糖发酵培养基、营养肉汤培养基、改良马丁液体培养基、改良马丁琼脂培养基、MUG培养基、靛基质试液。

　　1.2 菌种

　　大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。

　　1.3 供试品

　　龙胆泻肝丸。

　　2 菌液的制备

　　2.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液制备

　　取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物接种于10ml营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时;取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6或10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。

　　2.2 白色念珠菌菌液制备

　　取白色念珠菌的改良马丁琼脂斜面培养物接种于10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时;取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6或10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。

　　2.3 黑曲霉菌液制备

　　取黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

　　3 供试液的制备

　　取供试品10g，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪混匀，作为1:10供试液。

 　 4 回收率测定

    4.1.1 试验组

　　(1)常规法：取1:10供试液1ml、菌液(10-6约50～100cfu)1ml，分别同时注入于平皿中，做10个平皿;立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃培养48小时，逐日观察结果。(2)稀释法：取1:10供试液1ml等量分注入于5个平皿中，每个平皿加试验菌 (10-6约50～100cfu)1ml，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃培养48小时，逐日观察结果。

　　4.1.2 菌液组 取上述试验菌液，测定每一菌株所加的试验菌菌数。采取平皿法，取试验用的菌液(10-6约50～100cfu)1ml，分别注入平皿中，立刻倾注培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。

　　4.1.3 供试品对照组 (1)常规法：取1:10供试液1ml注入于平皿中，做2个平皿;立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃温度培养48小时，逐日观察结果。(2)稀释法：取1:10供试液1ml等量分注于5个平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃培养48小时，逐日观察结果。

　　4.2 霉菌、酵母菌回收率测定

　　4.2.1 试验组 取1:10供试液1ml、菌液(10-6约50～100cfu)1ml，分别同时注入于平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，置23～28℃培养72小时，逐日观察结果。

　　4.2.2 菌液组 同4.1.2。

　　4.2.3 供试品对照组 取1:10供试液1ml注入于平皿中，立即倾注玫瑰红钠培养基，待凝固后，置规定温度培养72小时，逐日观察结果。

　　4.3 细菌、霉菌和酵母菌计数及验证结果

　　表1 细菌、霉菌和酵母菌计数及方法验证的试验　以上数据为3次试验结果(注：稀释法中枯草芽孢杆菌回收率不易达到70%)。

　　5 控制菌方法的验证

　　取2瓶100ml胆盐乳糖培养基，分别加入1:10供试液各10ml，其中1瓶加入大肠埃希菌液1ml,另1瓶加入金黄色葡萄菌液1ml，置35～37℃培养24小时，分别取上述培养液0.2ml接种于5mlMUG培养基中，培养于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液。试验重复3次(表2)。表2 控制菌检查方法验证试验结果

　　6 讨论

　　由表1结果看出，细菌、霉菌和酵母菌试验组的回收率在70%以上，说明龙胆泻肝丸微生物限度检查法的细菌数和霉菌、酵母菌数可以采用常规法和稀释法两种方法中的任一种进行测定。由表2结果可以看出，阳性对照菌检出，阴性对照菌未检出，说明龙胆泻肝丸控制菌检查可以采用常规法测定。

【参考文献】
  　1国家药典委员会编.中华人民共和国药典.北京：化工工业出版社，2005.

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