二、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳技术(Agarosegelelectroghoresis)是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度,并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应,此外,在弱碱性条件下,DNA分子带负电荷,从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同,它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭(EB)能与双链DNA结合的作用,利用EB染色,并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。
【材料】
1、琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液(40mMTris,20mMNaAc,1mMEDTA,PH8.0)
2、载体缓冲液(0.25%溴酚蓝,30%甘油)、溴化乙锭水溶液(10mg/ml)
3、凝胶槽、电泳仪
【方法】
1、取琼脂糖0.9g,加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中,100℃加热溶解。
2、平衡凝胶槽,放好两侧挡板,调节好梳子与底板的距离(一般高出底板0.5~1mm)。
3、铺板:在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液,轻轻混匀,待冷至500C左右倒入凝胶槽,胶厚一般为5~8mm。
4、待胶彻底凝固后,去掉两侧挡板,将凝胶放入盛有电泳液的槽中(加样孔朝向负极端,DNA由负极向正极移动),使液面高出凝胶2~3mm,小心拔出梳子。
5、DNA样品与载体缓冲液5:1混合并加入凹孔中(样品不可溢出)。
6、打开电源,调节所需电压,电压与凝胶的长度有关,一般使用电压不超过5v/cm。
7、据指示染料移动的位置,确定电泳是否终止(溴酚蓝的涌动距离在5sRNA和0.3kbDNA带之间)。
8、电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。