腺病毒的包装，纯化和感染
录入时间:2011-9-6 16:39:38
来源：生物在线
腺病毒的包装，纯化和感染
技术背景：Adeasy 系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，
并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、高效的病毒载体。
利用带有E1 基因的293 细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并
通过CsCl 梯度离心，透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100
％的感染效率。但需要指出的是Adeasy 同样具有所有病毒载体或转染试剂都不
可避免的细胞毒性问题。
所需试剂：
293 细胞；
重组好的腺病毒质粒；
Pac I 限制性内切酶；
质粒回收相关试剂；
细胞培养、转染相关试剂；
TBS：10mM Tris, 0.9% NaCl, pH8.1;
40% CsCl：28.45 g CsCl 溶于42.7 ml 的TBS 中，4 度保存；
15% CsCl：9.085 g CsCl 溶于47.69 ml 的TBS 中，4 度保存；
Beckman 离心管：14*89 mm，SW41 转头；
Polybrene (sigma)，10 mg/ml；
透析袋：Spectrum Co. （成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属），
MW=8000~14400；
灭菌甘油。
操作流程：
1. 293 细胞（E1-transformed human embryonic kidney cells 在转染前24 小时接种
于1 或2 个60 mm 培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70%；
2. 在转染前，用Pac I 处理目的质粒（一般一个60 mm 细胞盘需要6μg DNA）。
处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20 μl 无菌水中；
3. 用PEI 或其他转染试剂将6 μg Pac I 处理过的质粒转染细胞；
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4. 8 个小时后移去混合液，加入4 ml DMEM 完全培养液（10% CBS，1%
Pen/Strep）；
5. 在转染后7 到10 天用细胞刮（而不是胰酶）将细胞从瓶中刮下并移入50ml
锥形管。离心后将细胞重悬于2.0 ml PBS 或全培液中。于液氮中冻结细胞，
37℃水浴中溶解，剧烈振荡。此步骤共进行4 次。注意保存时不要反复冻融，
可保存于-20℃；
6. 将293 细胞以50-70%的汇合率铺于60 mm 培养盘中，以30-50%的体积比加
入含病毒上清液。在感染后2-3 天即可看到明显的细胞裂解或CPE 现象；
7. 在有1/3 到1/2 的细胞脱离漂浮时，通常是感染后3-5 天收集病毒。可进一
步通过Western blot 或PCR（5 μl 病毒上清加上10 μl PCR-grade Protease K，
55℃消化1 小时，然后煮沸样品5 min，离心后取1-2 μl 进行PCR 反应）证
实重组腺病毒的存在；
8. 按步骤5 的方法收集病毒上清。在这种情况下一般至少可收集到107 infectious
particles/ml 的病毒。每轮的扩增应能提高一个数量级的梯度；
9. 为了进一步扩增，将步骤8 获得的病毒上清进一步感染100 mm 培养盘的细
胞，按步骤5 的方法收集病毒，并进而将其感染150 mm 细胞培养盘中的293
细胞，以获得足够量的病毒；
10. 将15% CsCl 和40% CsCl 加入Beckman 离心管中制备CsCl 梯度溶液；
11. 将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl 梯度溶液上；
12. 超速离心，30000 rpm，4 度离心16 个小时；
13. 离心后，应有两条带。位置较高，颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳，不具
感染能力；位置较低，颜色较亮的条带含有我们需要收集的活病毒颗粒。用
16 号针头将这一条带收集；
14. 在TBS 中透析一小时，随后在含有10％甘油的TBS 中透析两次，每次一小
时；
15. 将纯化的腺病毒分装于EP 管中；
16. 在Eppendorf Biophotometer 中测量透析液中的总蛋白量，1μg 病毒蛋白相当
于4×109 病毒颗粒；
17. 长期保存于-70 度中，短期可保存于4 度，切忌反复冻溶；
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18. 由于腺病毒对不同细胞株的感染效率存在差异，且考虑到病毒颗粒的细胞毒
副作用，通常通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量。以相对细胞数1：1，
10：1，100：1，1000：1 的病毒颗粒感染靶细胞；加入相对培养液体积1：
1000 的Polybrene。在37 度下平板离心30 分钟；
19. 感染8~12 小时后换液。将含有病毒的培养液小心移入含有消毒液的废液缸
中，加入适量全培液。
参考文献：
1．Proc. Natl. Acad. Sci. USA，Vol. 95, pp. 2509–2514, March 1998，A simplified
system for generating recombinant adenoviruses.
2．Current Protocols in Human Genetics (2004) 12.4.1-12.4.25.
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