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食源性致病菌检测技术(11)



录入时间:2011-9-2 9:51:16 来源:食品伙伴网

 

致泻性大肠埃希氏菌

    致泻性大肠埃希氏菌能使人类致病,监诊表现主要为严重腹泻,多数表现为败血症。根据血清型别、毒力和所致临床症状可分为产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)以及肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)五类。 

1.常规分离鉴定技术:按照GB/T4789-2003方法进行

    酶联免疫法(ELISA):应用O157:H7多克隆抗体包被酶标板,加入适当稀释与处理的粪便标本后,再与过氧化物酶标记的抗O157:H7抗体结合,加底物显色,此法可直接检测粪便中O157:H7大肠埃希氏菌抗原,结果与细菌培养法一致。 

    免疫磁珠分离法(IMS):用免疫磁分离法检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157:H7。可提高了大肠杆菌O157:H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。 

2.快速酶触反应:大肠埃希氏菌具β-葡萄糖醛酸酶,但以O157:H7为代表的肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)却不具此酶。 

    毒素及毒力因子检测:包括LT、ST、Hly、SLT、Stx、EaeA、VT、EAST等,过去多用动物或细胞培养测定,现可用其单抗以多种免疫学手段检出,也可用基因探针技术或PCR等分子生物学技术检测。同时检测HlySLT基因,能快速检测和鉴定EHEC菌株,并与EPEC区分开来。 

    基因探针和PCR技术:国内徐建烟根据溶血素hlyAB基因序列设计了鉴定EHEC的特异DNA探针,敏感性特异性达99%。Fortin将套式PCR技术和荧光探针技术相结合来检测O157,该方法不仅可以鉴定与O157抗血清有交叉反应的菌株,而且灵敏度高,可检测牛奶和苹果汁中102CFU/ml,的细菌,如果先进行6h增菌,可检测1CFU/ml的细菌。

基因芯片:Chizhikov6个编码大肠杆菌细菌抗原和毒力的特异基因探针(EaeA,SltI,SltII,FliC,RfbE,IpaH)点样在玻片上,取多重PCR扩增产物与之杂交,用于同时检测和鉴定食物中毒相关的肠道病原体,该芯片可同时检测15种沙门菌、志贺菌和大肠杆菌的毒力因子。 

    细胞粘附试验:传统的细胞粘附试验是检测EIEC的标准方法。方法为在24孔板的孔中圆形玻片上培养的HEP-2细胞单层,生长致50%;待检菌以L肉汤培养,37,静止培养16h;每孔加入20ul菌液(含2×107个菌),置37,5%CO2温育3h,培养液中含1%α-甲基-D-甘露醇;Hanks平衡盐溶液洗培养板3次;70%乙醇固定,10%Giema染色,取出圆形玻片,置载玻片上,油镜观察。 

3.分子流行病学分型方法

    血清型分型技术:包括O、K、H、F四种抗原。O抗原共171种,其中162种与腹泻有关,是分群的基础。K抗原103种。从病人新分离的大肠埃希氏菌多有K抗原。根据耐热性等不同,K抗原分为L、A、B三种,其中L、B不耐热,有60种。F抗原至少有5种,与大肠埃希氏菌的粘附作用有关。血清型的表示方式可按O:K:H排列,例如O:K:HO111:K58B4):H2;O:KO8:K88;O:HO168:H27。 

    脉冲场电泳(PFGE)分型:用核糖体分型和脉冲肠电泳技术,对急性分泌型腹泻病人中分离的ETEC病原菌分析,血清型相同的ETEC菌株具有遗传异质性,不同血清型的ETEC菌株其PFEG型一致。美国国家公共卫生实验室已完成了PFGE的标准化流程的制定。 

    随机引物扩增DNA多态性(RAPD)和扩增片段长度多态性(FAFLP)分析分型技术:用随机扩增多态性DNA技术(RAPD)分析,发现具有相同表型特征的ETEC菌株,用分子生物学分型方法能揭示菌株间的差异,这些差异往往在不能在对ETEC的表型中显示出来。有学者认为FAFLPPFGE具有更高的鉴定能力,扩增片段可精确到±1bp。

噬菌体分型:目前,通过对噬菌体感受性的不同,已获得80余种噬菌体型。

 

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