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包涵体表达的蛋白的复性(四)



录入时间:2011-9-1 17:01:01 来源:中国生命科学实验

几个复性的实例:

1、MHCII JBC 269(47):1994

增溶:16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.

复性:8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.

2、增溶:10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.

复性:10倍稀释到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.对起始缓冲液密闭透析16hr,开口透析8hr,对150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。

3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。

增溶:7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.

复性:稀释到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次,温度4度。

纯化:

一般说来,复性液的体积较大,为了减少处理体积,在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀,沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高,可以直接进行HIC纯化,目标峰经适当稀释后(cond<5mS/cm)进行IEX纯化,然后通过SEC脱盐,更换缓冲液,除菌过滤后,在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。

当然在复性浓度较高的情况下,也可以直接将复性液进行IEX纯化,优点是在纯化的同时进行体积的浓缩,为以后的精制创造条件。

从生产的角度看,由于每增加一步纯化工序便降低很多收率,所以可过两到三次柱纯化,工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则,对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白,不得不进行多次纯化。

 

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