2 玫瑰组织培养的方法

    2.1 外植体选取 从生长在田间或盆栽的优良品种植株上，选取生长健壮、无病虫害的当年生枝条的茎尖和幼茎。取材最好在晴天正午，并且取用植株上部的幼茎。阴雨天或靠近地面的幼茎，表面污染较为严重，难于消毒。玫瑰除用茎尖和幼茎做外植体外，也可以用叶片、叶柄、根、茎、原生质体、胚、花药、子房、花萼和花托做外植体［7］。

    2.2 消毒灭菌及无菌苗的建立 取玫瑰外植体，用5%～10%的次氯酸钠浸泡10～30min或用01%～02%的HgCl浸泡5～15min。用无菌水清洗7～10次后接种。也可先用75%的酒精浸泡20～30s再采用上述方法消毒。消毒灭菌完毕后，将幼茎切割成05～10cm长的至少带有一个节的切段，接种于培养基中［6］。

    2.3 愈伤组织的诱导 Hill(1967)最早报道从杂交茶香月季（hybridtea rose）的茎上诱导了愈伤组织，该实验证明在培养基中添加2，4-D或添加NAA和激动素KT均能很快诱导出愈伤组织。随后不同实验以不同品种为试验材料，从叶、叶柄、根、茎、原生质体、合子胚、花药、子房、花瓣、花萼、和花托成功地诱导了愈伤组织。［7］

    2.3.1 愈伤组织的成功诱导与品种的基因型有关?摇Lloyd等（1988）曾研究Rose prsica与xanthina，hybrida，Clarissa，Rcabrosa的愈伤发生能力，发现只有Rose persica与xanthina在MS基本培养基上，添加低浓度的BAP和NAA时，节间能产生愈伤，愈伤组织脆弱，呈淡黄绿色。Kunitake等(1993)研究了Rose rugosa Thunb，Rose multiflora，Rose allbacv，SemiplenaRose hybridacv，DuplesRose harisonii，Roses pinosissi的未成熟种子的愈伤发生能力，发现只有Rose rugosa Thurb能产生愈伤组织，品种Rontl和Soraya比品种Baccara和Mercedes更易产生愈伤(Kintzioses等，1999)。［7］

    2.3.2 外植体类型?摇Aren等（1993）详细地调查了Rose hybrida cvMeirutral不同外植体的愈伤诱导率，发现不同外植体愈伤产生的能力不同，叶为90%，根为70%，节间为55%，花药为19%。

    2.3.3 激素 激素也是影响愈伤生成的重要因素，Rout等（1991）以Landora为材料，在添加BA和NAA，2，4-D的MS的培养基上，外植体在接种的7～12d后，在近轴面的叶柄和中脉处产生愈伤，愈伤组织诱导频率高达92%。在接种后15～20d，外植体茎切端处产生愈伤，诱导率为76%。生长素种类和浓度对愈伤产生能力的影响同样很大。早期实验多采用NAA结合BAP或BA等，近年来多采用2，4—D，并证明2，4—D是诱导愈伤的必要因素（Kintzioses等，1999；Rout等，1996；van der Salm等，1996；Vises—suwan等，1997）。进一步研究发现2，4-D对愈伤的诱导效果依赖于月季的基因型，如2，4—D浓度从113umol/L增加到181umol/L降低了Rose hybrida栽培种“Care-freeBeauty”的愈伤诱导频率，但该浓度则对另一个品种“Grand Gala”无影响。对于“Red Sunblaze”而言，当浓度从113umol/L增加到452umol/L，则表现出愈伤的诱导率提高了，随后当2，4—D再增加，则显著地降低愈伤的诱导频率。愈伤组织在诱导愈伤组织的培养基上能得到很好继代培养（subculture、Li等，2002）。Van der Salm等（1996）证明2，4—D对诱导Rose persica与xanthina和Moneyway产生愈伤是非常必要的，进一步添加低浓度的BA有正效应，但如BA浓度过高，则产生抑制作用。与以上实验结果不同，Kintzioses等（1999）则发现2，4—D对愈伤诱导有负影响作用，可能因为采用的外植体是成熟的叶片。

    2.3.4 合子胚的发育时期对愈伤的形成能力也有影响?摇如处于心形胚的合子胚，其愈伤诱导率只有2%，子叶胚时的合子胚愈伤诱导率达到85%。［7］

    2.4 不定芽的诱导 月季的常规繁殖方式主要靠扦插、嫁接和压条等，繁殖系数低，远远满足不了生产的需要。80年代初，采取组织培养方法快速繁殖月季苗，用侧芽、顶芽、并诱导生根。第一报道月季不定芽形成见Elliott(1970)，他在聚花月季（Rose multiflora）上成功地诱导了不定芽的形成，并诱导幼苗生根。Zieslin和Halevy(1976)报道细胞分裂素有利于提高不定芽的数量，但也诱导花器官败育或退化的频率。不定芽的诱导与供试材料的基因型有关，同时还与外植体的取材部位有关，来源于枝条中部的侧芽的繁殖速率最快（Bressan等，1982）。培养基中添加蔗糖有增加丛芽数量的作用（Langford和wainwright，1987）；加入低浓度的GA能进一步改善芽繁殖，95%的外植体能产生7个以上的不定芽（Rout等1990）。能提高芽繁殖数量的物质还有月桂酸甲酯（Voyiatzi等，1995）、乙烯（Kevers等，1992）等。诱导不定芽的培养基为MS培养基添加低浓度的激素BAP03～05mg/L，NAA0004～03mg/L或IAA或GA00～20mg/L。［7］Martin等（1981）调查了2125个玫瑰侧芽做外植体获得的无菌苗三年间在大田生长的情况，没有发现变异植株，这说明侧芽方式繁殖的玫瑰植株性状很稳定。

    2.5 增殖培养 玫瑰的增殖培养，一靠无菌苗切段繁殖，二靠诱导不定芽，形成从生苗；三靠愈伤组织形成体细胞胚或原球胚。将已长大的月季嫩茎切成带1～2个节的茎段，投入新鲜的增殖培养基上，5～6周进行一次继代增殖，增殖系数平均达4～6。在外植到培养10～15d内第一叶的叶原基伸长，第二叶片叶原基可见；15～20d侧芽伸长；25～30d长度达6～10mm，继代增殖会按几何级数增长起来。［5］增殖培养基可用不定芽诱导培养基，如MS+BA03～05+NAA0004～03mg/L。

    2.6 壮苗与生根 壮苗培养的培养基为：MS+BA03～05+NAA001～01或MS+BA03～05+IBA03。 ［4］也可以壮苗为主，增殖为辅，使增殖与壮苗合二为一。玫瑰组培苗增殖与壮苗需光照10～12h，光照强度2000lx，温度24～26℃。［4］

    玫瑰在组培过程中，其生根能力因品种特性、所用植物材料及培养基成分而有较大差异，许多研究结果表明，玫瑰茎段微繁殖容易生根，使用植物激素IAA，IBA或NAA含量01～05mg/L，蔗糖含量2%～25%的MS培养基有利于玫瑰茎段生根。另外，光照、温度等对玫瑰微繁殖生根也有直接影响，Bressan等（1982）研究指出，光照时间每天12h以上，光照强度适宜则有利于生根。一般情况下，玫瑰茎段组织培养8～10d内则可生根。［6］加入适量的活性炭有利于玫瑰生根。

    2.7 炼苗与大田移栽 炼苗和大田移植是玫瑰微 繁殖获得成功的最后阶段。［6］组培幼苗由人为培养环境转移到天然生长环境中，环境条件发生巨大变化，湿度大幅度降低，温度不恒定，光照强烈，微生物多，故需炼苗过渡。一般玫瑰微繁殖炼苗需经过室内三天的取盖炼苗，然后将苗从瓶中取出，洗去根部培养基，定植在珍珠岩、泥炭、蛭石或沙土中，用3～5%的多菌灵喷洗。炼苗时要注意基质中的水分含量，水分太少，不能满足苗生长发育；水分太多，导致烂苗。炼苗中、后期要注意通气，给予足够的光照，其幼苗成活率可达80％以上。［6］

 

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