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细菌抹片的制备及染色



录入时间:2011-8-23 9:36:03 来源:百度

 

目的要求

1.掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法。

2.认识革兰氏染色的反应特性。

操作步骤

染色是细菌学上一个重要而基本的技术。由于细菌个体微小,且半透明,如不经染色往往不易识别。因此,借助于染色法可使细菌着色,与背景形成鲜明的对比,便于在显微镜下进行观察。也可根据不同的染色反应,作为鉴别细菌的一种依据。

一、载玻片处理

载玻片应清晰透明,清洁而无油渍,滴上水后,能均匀展开,附着性好,如有残余油渍,可按下列方法处理。

(一)滴上95%酒精23滴,用清洁纱布擦拭,然后以钟摆速度通过酒精灯焰34次。

(二)若上法仍未能除去油渍,可再滴上12滴冰醋酸,用纱布擦净,再在酒精灯火焰上轻轻拖过。

玻片洁净后,用玻璃铅笔在预涂材料处的背面划一个直径1.5cm的圆圈,用以标记。

二、涂片方法

(一)菌落涂片方法  涂片时,左手握菌种管,右手持接种环(又称铂金耳)取12环生理盐水,置于载玻片上,然后将接种环在火焰上灭菌,待冷后,从菌种管内钓取少许菌落,置于生理盐水中混匀,涂成直径1.5cm的涂膜,此膜既薄又均匀为好,待干即成。

(二)菌液涂片法  用灭菌接种环沾取菌液(液体培养物、血清、乳汁、组织渗出液等)12接种环,均匀涂抹在载玻片上,使成直径为1.5cm左右圆形或椭圆形涂膜,自然干燥后备用。

(三)血液涂片方法  先取一张干净无油垢边缘整齐的载玻片,其一端沾取少许血液,以45度角放在另一张干净无油垢的载玻片一端,从这端向另一端推成薄而均匀的血膜,待干后备用。

(四)组织涂片方法  先用镊子夹持组织局部,然后以灭菌剪刀剪取一小块,夹出后以其新鲜切面在载玻片上压印或涂成一薄层。

三、干燥

涂片最好在室温中自然干燥。必要时,可将标本面向上,在离酒精灯火焰远处烘干,切勿紧靠火焰,以免标本糊焦而不能检查。

四、固定

有两种固定方法

(一)火焰固定  将已干燥好的抹片,使涂面向上,以钟摆速度通过酒精灯火焰四次,使固定后的标本触及皮肤时,稍感烧烫为度。放置冷却后,进行染色。

(二)化学固定  血液、组织脏器等抹片作姬姆萨氏染色或单染色时,不用火焰固定而用甲醇固定,可将已干燥的抹片浸入甲醇中23分钟,取出晾干;或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用23分钟后,自然挥发干燥,抹片作瑞特氏染色时则不必作特别固定,染色液中含有甲醇可以达到固定目的。

抹片固定的目的是:

1.使菌体蛋白凝固附着在载玻片上,以防染色过程中被水冲掉。

2.改变细菌对染料的通透性,因活细菌一般不允许染料进入细菌体内。

3.能杀死抹片中的部分微生物。

必须注意,在抹片固定过程中,实际上并不能保证杀死全部细菌,也不能完全避免在染色水洗时不将部分涂抹物冲掉。因此,在制备烈性病原菌,特别是带芽胞的病原菌抹片和染色时,应严格处理染色用过的残液和抹片本身,以免引起病原的散播。

五、几种常用的染色方法

(一)单染色法  只应用一种染料进行染色的方法,如美蓝染色法。

美蓝染色法:在已干燥、固定好的抹片上,滴加适量的(足够覆盖抹片点即可)美蓝染色液,经12分钟,水洗,沥去多余的水分,吸干或烘干(不能太热),然后镜检。

(二)复染色法  应用两种或两种以上的染料或再加助染剂进行染色的方法。染色时,有些是将染料分别先后使用,有些则同时混合使用,染色后不同的细菌和物体或者细菌结构的不同部分,可以呈现不同颜色,有鉴别细菌的作用,又可称为鉴别染色,如革兰氏染色法,抗酸染色法,瑞特氏染色法和姬姆萨氏染色法等。

1.革兰氏染色法

1)在已干燥,固定好的抹片上,滴加草酸铵结晶紫染色液,经12分钟,水洗。

2)加革兰氏碘液于抹片上媒染,13分钟,水洗。

3)加95%酒精于抹片上脱色,约30秒至1分钟,水洗。

4)加10倍稀释石炭酸复红液复染12分钟,水洗。

5)吸干或烘干,镜检。革兰氏阳性细菌呈蓝紫色,革兰氏阴性细菌呈红色。

2.抗酸染色法

1)在已干燥,固定好的抹片上滴加较多量的石炭酸复红染色液,将玻片置酒精灯火焰上缓缓加热,至产生蒸汽即止(不要煮沸),维持微微产生蒸汽,经35分钟,水洗。

2)用3%盐酸酒精脱色,直至标本无颜色脱出为止,充分水洗。

3)用美蓝染色液复染约1分钟,水洗。

4)吸干或烘干,镜检。抗酸性细菌呈红色,非抗酸性细菌呈蓝色。

3.瑞特氏染色法

抹片自然干燥后,滴加瑞氏染色液于其上,为了避免很快变干,染色液可稍多加些,或者看情况补充滴加,经13分钟,加约与染液等量的中性蒸馏水或磷酸盐缓冲液,轻轻晃动玻片,使与染液混匀,经3分钟左右,直接用水冲洗(不可先将染液倾去),吸干或烘干,镜检。细菌染成蓝色,组织、细胞等呈其他颜色。

4.姬姆萨氏染色法

1)于5ml新煮过的中性蒸馏水中滴加510滴姬姆萨氏染色液原液,即稀释成为常用的姬姆萨氏染色液。

2)抹片经甲醇固定并干燥后,在其上滴加足量的染色液或将抹片浸入盛有染色液的染色缸中,染色30分钟,或染色数小时至24小时,取出水洗,吸干或烘干,镜检。细菌呈蓝青色,组织、细胞等呈其他颜色。视野常呈淡红色。

5.荚膜染色法

1)涂片、干燥  同单染色法。

2)固定  滴加甲醇液于涂抹面上,固定23分钟。

3)水洗  倾去甲醇液,用水轻微冲洗。

4)染色  滴加碱性美兰染色液数滴于涂抹面上,染色23分钟。

5)水洗  倾去染色液,用水轻微冲洗。

6)干燥,镜检  菌体染成蓝色,荚膜染成粉红色或无色。

荚膜染色的原理:荚膜染色主要用于炭疽杆菌病料的荚膜检查。因为炭疽杆菌荚膜系由d-谷氨酸组成的多肽所构成,而菌体的主要成分则为核蛋白,因二者着色力不同,染色水洗后,则可把荚膜上一部分染料冲洗掉,颜色变淡,故显微镜检查时,在着色较深的菌体周围看到一圈呈淡紫色的膜,即荚膜。又因碱性美兰是一种多染性染料,故菌体染为蓝色,荚膜则染成淡蔷薇色。

6.芽胞染色法

1)将有芽胞的材料作涂片、干燥、固定。

2)将5%孔雀绿水溶液滴加于固定好的涂片上。

3)用木夹夹住载玻片在酒精灯火焰上加热,使染料冒蒸汽(但不能煮沸),切勿使染料蒸干,必要时可添加少许染料。加热时间从冒蒸汽时开始计算约45分钟。

4)倾去染色液,待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。

5)用0.5%沙黄水溶液复染1分钟,水洗。

6)干燥或烘干后,置油镜观察,芽胞呈绿色,菌体呈红色。

7.鞭毛染色法之一

1)涂片  1012小时的幼龄培养菌,用1%福尔马林水溶液制成菌液,在37温箱中固定24小时,涂抹于载玻片上。

2)自然干燥,不固定。

3)用下述染色液加温染色30秒到1分钟,然后静置12分钟。

4)染色液配制

0.5%苦味酸水溶液(加温溶解后过滤)1.0ml。

20%鞣酸水溶液(加温溶解,不过滤)1.0ml。

5%钾明矾水溶液(加温溶解后过滤)0.5ml。

10%复红酒精溶液(配制后7天过滤)0.5ml。

上述染色液在用前,按①、②、③、④的顺序混合后,即可使用(染色液现配现用)。

4)水洗、干燥、镜检。

5)结果  菌体呈深红色,鞭毛呈淡红色。

8.鞭毛染色之二

1)脱脂玻片的准备  要用新的或表面没有磨损痕迹的玻片。先用洗衣粉煮1015分钟,取出玻片用清水洗净,再放入洗涤液中浸泡24小时左右,取出后,用自来水和蒸馏水洗净,再用95%酒精脱脂,用火焰烧去酒精,即可使用。如不立即使用,可在脱脂后放于干净的盒中,或浸泡于95%酒精中,用前在火焰上烧去酒精,冷却后使用。

2)菌种  最好应用有冷凝水的新制琼脂斜面接种,培养1012小时应用。如所用菌种久未移植,最好在这种斜面上每天移植一次,连续移植23次后使用。

3)染色液的配制

甲液: 

单宁酸            5g

FeCl3             1.5g

蒸馏水            100ml

15%福尔马林      2.0ml

1NaOH          1.0ml

配好后,当天使用,次日效果差,第3天则不好用。

乙液: 

AgNO3      2g

蒸馏水      100ml

AgNO3溶解后,取出10ml备用,再向余下的90mlAgNO3中滴入浓氨水,使之成为很浓的氢氢化银,再继续滴加氨水变为透明,直到重新形成的沉淀物又刚刚溶解为止。再将备用的10ml AgNO3慢慢滴入,则出现薄雾,但轻轻摇动后,薄雾状沉淀又消失,再滴入AgN03,直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。如所呈薄雾不重,即可使用,此染剂可使用一周。如雾过重、则银盐被沉淀出,不宜使用。

4)染色方法  在载玻片一端加蒸馏水一滴,再用接种环钓取少量细菌于水滴中沾几下,将载玻片倾斜,使水滴流到另一端,然后将载玻片稍斜或平放,在空气中干燥后,在涂片上滴加甲液染色24分钟,用蒸馏水冲洗,将残水甩干,或用乙液冲去水后,再加乙液染色3060秒钟,然后用蒸馏水冲洗,在空气中晾干,镜检。如未见鞭毛,应在整个涂片上多找几个视野,有时只在部分涂片上染出鞭毛来。如加乙液后,将载玻片在酒精灯上稍加热,使其微冒蒸汽且不干,则效果更好。

9.立克次氏体染色法

1)涂片  以病料制成涂片。

2)干燥、微加温固定。

3)染色  滴加0.25%碱性复红水溶液(染色液调至pH7.27.4),用滤纸过滤,染色4分钟。

4)脱色  0.5%枸橼酸把多余的染色液洗脱掉。

5)水洗

6)复染  1%美兰水溶液复染数秒钟。

7)水洗、干燥、镜检。

8)结果  立克次氏体呈红色,其他组织细胞呈蓝色。

 

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