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包涵体表达蛋白质的优越性



录入时间:2011-8-15 15:28:38 来源:百度

为了研究基因的功能,可以把体内的基因转移到其他表达宿主中,研究基因表达性状以确定基因的功能。但是,外源基因的表达,特别是真核生物基因在大肠杆菌中的表达,由于宿主菌缺乏此种基因表达的调控机制,细胞内的化学环境与其天然环境差异,如氧化还原环境、胞内pH、自由水的浓度,以及外源基因的导入,使得表达目的蛋白质的细胞在非正常状态下生长,表达的蛋白质多数以无活性的包涵体的形式存在。
  在下游生产过程中特别是在医药生产中,以包涵体形式表达的蛋白质具有一些优越性。
  (1) 异源表达的蛋白质很容易被宿主细胞内的蛋白质酶降解,如果重组蛋白质以包涵体形式表达,由于包埋了酶攻击的位点,可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击;
  (2) 包涵体表达的蛋白质没有活性,细胞破碎和以后的纯化步骤不用考虑蛋白质的失活问题;
  (3) 包涵体形式表达的蛋白质与宿主细胞的其他蛋白质的分离比可溶蛋白质的分离方法简便,造价低,使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离;
  (4) 有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死,大量表达时会导致细胞的死亡,最终的细胞数量和产物相当低;而包涵体形式的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达;
  (5) 对于以包涵体形式表达的产物可以比较容易进行在线观测定性,含有包涵体蛋白质的细胞有较大的折射率,不必像可溶的蛋白质需要细胞破碎后使用酶学或者电泳学的方法进行鉴定。
  包涵体的形成和蛋白质在等电点或者高盐情况下的沉淀是不同的。在沉淀过程中,分子是通过分子表面的相互作用而形成的分子的聚集,无论在聚集的沉淀状态还是在天然状态,没有明显的构象的变化。因此,当溶液中的pH重新改变,或者沉淀重新溶解的时候,蛋白质的结构和活性会重新获得。蛋白质的包涵体形式的聚集则不同于蛋白质的沉淀,把包涵体蛋白质直接溶解在天然的缓冲液中得不到天然的构象,无活性的聚集体与其天然活性形式之间没有自然的平衡转化的过程。包涵体的形成是由于范氏引力、疏水作用力和二硫键等作用力形成的,破坏这些作用力比较困难,溶解包涵体需要加入强的变性剂破坏多肽链之间的作用力,说明聚集体的多肽链之间的作用力远远大于普通的沉淀的分子间的作用力。当变性剂溶解的包涵体只是简单地通过稀释或者透析除去变性剂,而不是寻找合适的复性的条件的话,聚集体会重新形成,并且,不同于沉淀溶解的100%的活性的保留,包涵体的复性水平往往很低。所以,蛋白质沉淀是活性的天然蛋白质之间的作用力形成的,而包涵体的形成是在细胞内新合成的蛋白质肽链中间体而形成的,体外折叠时的聚集体是折叠过程中折叠中间体形成的。这些折叠的中间体并不一定是形成高级天然结构的中间体,从天然结构也不能推论出折叠中间体的构象。

 

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