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PCR方法检测病原微生物



录入时间:2011-8-11 15:19:12 来源:生物在线

    多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种模拟天然DNA复制过程,在体外扩增特异性DNA(或RNA)片段的新技术。本实验是将待检双链DNA经94℃高温变性成单链作模板,然后加入一对人工合成的寡核苷酸引物,引物分别与待扩增DNA片段的两端互补,经55℃低温退火,引物与模板互补结合。在72℃条件下,结合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下,利用反应体系中的4种dNTP为原料,按碱基互补配对的方式延伸合成两条新的DNA链。经过20-30个周期后,特异的目的DNA可扩增百万倍以上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后即可观察到特异的扩增条带。
  PCR方法操作简便,灵敏度高,可检测出少至0.1pg的目的DNA。目前已广泛应用于多种病原微生物及寄生虫的检测。
  【材料】
  1.无菌双蒸水、石蜡油、溴化乙锭
  2.10×PCR反应缓冲液
  3.25mmol dNTP混合液
  4.引物1,引物2各50pmol/u1
  5.模板DNA
  6.5U/ul Taq DNA聚合酶
  【仪器】
  1.PCR扩增仪
  2.电泳仪
  3.紫外线分析仪
  【方法】
  1.在0.5m1EP管中,加入以下成分:
  10×PCR反应缓冲液 5u1
  引物1 2ul
  引物1 2ul
  模板DNA 10u1
  dNTP混合液 4ul
  Taq DNA聚合酶 1ul
  无菌双蒸水 加至 50ul
  混匀, 加50 ul石蜡油,防止样品水分蒸发。
  2.将反应管置于PCR仪中,94℃变性4min。然后按94℃变性30s→55℃退火30s→72℃延伸1min,循环35次后,72℃延伸10 min。
  3.反应完成后,取l0ul PCR扩增液,加至2%琼脂糖凝胶中进行电泳,电压100V,电泳30~60min后,置紫外线分析仪下观查扩增结果。

 

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