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沉淀反应



录入时间:2011-8-5 14:49:16 来源:百度

  

目的要求

1.了解沉淀反应在预防医学和兽医学中的意义。

2.初步掌握炭疽沉淀原的制备和环状沉淀反应,琼脂扩散反应的操作方法。

原理  将可溶性抗原与相应的抗体混合,在适量电解质存在下,经过一定时间,即可形成肉眼可见的沉淀物,称为沉淀反应。参与沉淀反应的抗原称为沉淀原,抗体称为沉淀素。

沉淀反应通常都是利用已知抗体检查未知抗原,以诊断传染病。但也用于以已知的抗原测定未知的抗体,以测定免疫血清的效价和诊断疫病。

操作步骤

一、环状沉淀反应(以炭疽为例)

将含有抗原的透明浸出液重叠于含有抗体的免疫血清上,在两液交界处发生环状的白色沉淀物,即称为环状沉淀反应。

炭疽环状沉淀反应又称为阿斯可里(Ascoli)氏反应。具体操作方法如图实9-1所示。

(一)沉淀原的制备

1.热浸法  取被检材料(如各种实质脏器、血液、渗出液等)13g,在乳钵内研碎,然后加510倍生理盐水混合,用移液管吸至试管内,置于水浴锅中煮沸1530分钟,用中性石棉过滤,获得的透明滤液,即为被检的沉淀原。如果过滤液混浊不透明,可再过滤—次。

2.冷浸法  用以检查怀疑为炭疽病畜的皮革和兽毛等材料,操作前,先将其高压灭菌30分钟,以保证检查者的安全。然后取被检材料1g,浸于510倍的0.5%石炭酸生理盐水中,在室温下或普通冰箱浸泡1420小时,用中性石棉过滤,透明的滤液即为沉淀原。

(二)方法与判定

用毛细吸管吸取少量炭疽沉淀素血清,沿管壁徐徐注入沉淀反应管内,通常达管的1/3高处,再用另一支毛细吸管吸取制备的沉淀原,沿管壁缓慢注入,使之重叠于炭疽沉淀素血清上面,达到试管的2/3高处(注意!不要发生气泡或摇动)。直立静置,在15分钟内,两液面交界处若出现清晰、整齐的环状白轮,则为阳性。

为了验证反应的正确性,检验时可做如下三种对照试验;

1.炭疽沉淀素血清加标准炭疽沉淀原,应为阳性;

2.标准炭疽沉淀原加健康马血清,应为阴性;

3.生理盐水加炭疽沉淀素血清,应为阴性。

二、琼脂扩散沉淀反应(以炭疽为例)

抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶基质中可以向四周自由扩散,如果二者是相应的具有特异性,则在—定部位相遇,并发生反应,出现肉眼可见的白色沉淀线。此种反应为琼脂扩散沉淀反应。

由于一种抗原可能含有数种抗原成分,因而在凝胶中的扩散速度也不一样,所以在凝胶中可以和抗血清形成数条沉淀线,每一条沉淀线即代表一种抗原成分。所以琼脂扩散反应除用作微生物的鉴定、疾病诊断外,还可用作抗原成分的分析。该反应的操作方法如下:

(一)琼脂凝胶的制备

1. 取精制琼脂干粉11.2g,放入100ml1/万硫柳汞的磷酸缓冲液(PBS)或硼酸缓冲液(BBS)中,水浴加热融化混匀。

2.融化后以两层纱布夹薄层脱脂棉过滤,除去不溶性杂质。

3.将直径90mm的洁净平皿放在平台上。每平皿倒入热的琼脂1518毫升,厚度约2.5mm左右。注意不要产生气泡,冷凝后加盖,把平皿倒置,防止水分蒸发,放在普通冰箱中可保存2周左右。

4.将琼脂平皿放于事先绘制好的图案上,用打孔器照图案打孔,外周孔径为6mm,中央孔径为4mm,孔间距3mm,见图9-2。

(三)加样与判定

打孔后用琼脂写字墨水,在琼脂板上端写上日期及编号等。在中央孔加入标准炭疽沉淀原,在外周孔1、2、3、4,各加炭疽沉淀素血清至孔满为止。待孔中液体吸干后,将平皿倒置以防水分蒸发;将琼脂板放入铺有数层湿纱布的带盖搪瓷盘中,置1530℃室温或37恒温箱中,24小时后,即可出现较粗的白色明显的沉淀线用琼脂扩散反应诊断传染病,则是往中央孔滴加被检血清1滴(约0.0250.05ml),在周围孔滴加不同浓度的抗原各1滴,放湿盒中静置于室温下或37恒温箱中25天,观察结果。若阳性反应,则在抗原与抗体孔之间出现12条或多条白色沉淀线。阴性者,则无白色沉淀线。

 

 

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