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实验:培养基的制备



录入时间:2011-8-3 15:19:06 来源:互联网

 

 

目的要求

1.掌握一般培养基制备的原则和要求。

2.熟悉一般培养基制备的过程。

操作步骤

一、培养基的制备原则和要求

培养基是根据各类微生物生长繁殖的需要,用人工方法把多种物质混合而成的营养物。一般用来分离、培养菌类。常用的培养基有基础培养基、增菌培养基、选择培养基、鉴别培养基和厌氧培养基。在制备培养基时,应掌握如下原则和要求:

(一)培养基必须含有细菌生长繁殖所需要的营养物质。所用的化学药品必须纯净,称取的份量务必准确。

(二)培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。按各种培养基要求准确测定调节pH值。多数细菌生长的适宜pH值为7.27.6,呈弱碱性。

(三)培养基的灭菌时间和温度,应按照各种培养基的规定进行,以保证灭菌效果及不损失培养基的必需营养成分。培养基经灭菌后,必须置37温箱中培养24小时,无菌生长者方可应用。

(四)所用器皿须洁净,忌用铁或钢质器皿,要求没有抑制细菌生长的物质存在。

(五)制成的培养基应该是透明的,以便观察细菌生长性状以及其他代谢活动所产生的变化。

二、培养基制备过程

不同的培养基其制备方法也不同,一般包括以下步骤:

(一)准确称量试剂  根据不同的菌类和用途,选择适宜的培养基,培养基所需试剂必须纯净。

(二)校正pH  将称量好的培养基各种成分放入容器内,标记划线,加热溶解,补充水分,测定酸碱度,常用pH6.88.0的精密试纸或酸度计测定。用1N NaOH1N HCl调节pH值到适宜范围内。

(三)过滤  将玻璃漏斗置铁架上,再用纱布夹棉花或用滤纸放在漏斗中,将上述培养基倒入其中过滤至透明。

(四)分装  将过滤后的培养基分装于中试管或三角瓶内(试管内每支装5mL;三角瓶中装100150ml),塞好棉塞用牛皮纸包扎好,准备灭菌。

(五)灭菌  培养基的灭菌,常用高压蒸汽灭菌法。一般微生物的营养细胞在水中煮沸后即被杀死,但细菌的芽胞有较强的抗热性,须经高压蒸汽灭菌才能达到彻底灭菌的目的。根据蒸汽温度随压力升高而上升的原理,即压力越大,蒸汽温度就越高。因此,在同一温度条件下,采用高压蒸汽灭菌比干热灭菌法效果要好。而且在湿热情况下,菌体吸收水分后,其蛋白质易于凝固变性,因为蒸汽的穿透力强,杀菌效果好。

高压蒸汽灭菌,一般采用15/平方(即1.05kgcm2)压力,此时的温度是121.3。灭菌2030分钟后,可达到完全灭菌的目的。在进行灭菌的时候,首先要把灭菌锅内的冷空气排出,否则,冷空气存在会降低锅内的实际温度,影响灭菌效果。

三、基础培养基的制备

(一)牛肉浸液(肉水)

1.成分  新鲜牛肉 500g ,水1000 ml。

2.制法

1)取新鲜牛肉,剔除肌膜、脂肪,切成小块,用绞肉机绞碎。

2)按上述比例加水,浸泡过夜(夏天应将浸泡液放置在低温的地方,防止腐败;如果没有冷藏条件时,可省去浸泡过夜这一步),其间应搅拌数次。

3)次日取上液煮沸一小时,并不断搅拌。

4)补足蒸发的水分,用白布或绒布过滤后分装于三角瓶中,准备灭菌。

5)置高压灭菌器内,15灭菌2030分钟,置低温、暗处保存备用。

3.用途

用于制备各种培养基的基础液。

(二)肉浸液肉汤(普通肉汤)

1.成分  肉水 1000 ml ,蛋白胨 10g,氯化钠  5g,磷酸氢二钾 2g。

2.制法

1)将以上成份加温溶于牛肉浸液中。

2)调pH值为7.47.6。

3)滤纸过滤后分装。

4152030分钟灭菌后备用。

3.用途  作一般细菌培养用。

(三)营养琼脂培养基(普通琼脂)

1.成分  肉水 1000ml,蛋白胨10g,磷酸氢二钾 lg ,氯化钠 5g,琼脂 20g。

2.制法

1)将上述成分混合后,加热溶解,补足水份。

2)校正pH7.47.6。

3)用纱布夹棉花过滤。

4)分装于中试管或三角瓶中。

5)高压灭菌2030分钟后,将中试管摆成斜面,保存备用。

3.用途  一般细菌分离培养、菌种保存或用作特殊培养基。

(四)半固体培养基  基本上与营养琼脂的制备相同,仅将琼脂量减少至0.50.7%(1000 ml中加57g琼脂)即可。

(五)鲜血琼脂  将灭菌的营养琼脂加热溶化,冷却至4550℃时,加入58%无菌脱纤鲜血(绵羊、黄牛、马和兔等),分装于试管后立即摆成斜面、或倾注于平皿中,待凝固后,置37培养12日。有污染者废弃;无菌者保存,置冰箱备用。

 无菌脱纤维鲜血的制备:以无菌操作采取动物鲜血(绵羊、黄牛、马从颈静脉采血;兔则从心脏采血),放入带玻璃珠的无菌三角瓶内,摇动510分钟,放冰箱中备用。

 

 

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