（2）CaCl₂浓度细胞活性的影响

在海藻酸钠包埋固定化过程中，凝胶化剂CaCl₂中的Ca²⁺于海藻酸钠根离子螯合形成不溶于水的海藻酸钙凝胶，从而将细胞固定。CaCl₂溶液的浓度对固定化细胞颗粒机械强度的影响见表四。

 

表四 CaCl₂浓度对固定化细胞凝胶机械强度的影响

CaCl2浓度/%	2	3	4	5	10
机械强度	较好	较好	较好	好	好

 

随着CaCl₂浓度的增加，微生物细胞的活性降低。当CaCl₂浓度低于5%时，细胞活性可以保持在80%以上；但是当CaCl₂浓度达到10%，细胞活性下降到60%左右，主要原因估计有两种（i）由于盐的渗析作用，引起细胞脱水，致使微生物活性部分丧失；（ii）在PCR技术中，CaCl₂是使细胞处于感受态的物质，这个时候微生物是最脆弱的，很容易被外界的干扰破坏。

从表四可以看出，CaCl₂浓度对固定化细胞的机械强度影响较大。当CaCl₂浓度为2%~3%时，固定化颗粒在使用过程中会出现膨胀，甚至出现裂缝活破碎现象。因此，海藻酸钙包埋法固定化细胞活性较高。

3.2 PVA—H₃BO₃包埋法

3.2.1原理

聚乙烯醇是一种新型的微生物包埋固定化载体，它具有机械强度高，化学稳定性好，康微生物分解性能强，对微生物无毒，价格低廉等一系列优点，是一种具有实用潜力的包埋材料，近年来在国内外获得了较广泛的研究。

聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，简称PVA）的结构为：

 

    聚乙烯醇在加热后溶于水，在其水溶液中加入添加剂后发生凝胶化，或者在低温下（-10℃）冷冻形成凝胶，从而将微生物包埋固定在凝胶网络里。常用添加剂有硼酸和硼砂，在PVA水溶液中加入硼酸活着硼砂，由于化学反应而形成凝胶。PVA于硼酸反应形成的凝胶为单二醇型，与硼砂反应形成的凝胶为双二醇型，其结构式如图1（略）。

 

PVA于硼砂反应形成凝胶时，成形困难，凝胶呈海绵状结构，强度较低。但硼砂的用量较硼酸用量低得多，所以值的进一步研究。就目前的研究来看，大多采用H₃BO₃做交联剂。

PVA—H₃BO₃包埋法是一种制备容易且价格低廉的固定化方法，其反应原理如图2（略）。

利用该方法制得的凝胶颗粒机械强度高，使用寿命长且弹性好。

 3.2.2固定化方法

 以PVA为固定化载体，建立了利用PVA—H₃BO₃包埋固定化微生物细胞的方法，具体方法如下：

 方法I

①将聚乙烯醇（PVA）加热溶于水；

②将微生物细胞与PVA溶液混合均匀，使PVA最终浓度为10%；

③将上述混合液滴入饱和的硼酸溶液中，放置10h，使其充分反应；

④滤出固定化颗粒，用生理盐水洗净，备用。

方法II

①将聚乙烯醇（PVA）加热溶于水,冷却；

②将微生物细胞与PVA溶液混合均匀，使PVA最终浓度为10%；

③将PVA与微生物细胞的混合液到入已灭菌的培养皿中，缓慢加入饱和硼酸溶液，浸泡10h；

④将凝胶切成3mm×3mm×3mm的小方块，用生理盐水洗净，备用。

方法III

①将聚乙烯醇（PVA）与海藻酸钠加热溶于水,冷却；

②将微生物细胞与上述溶液混合均匀，使PVA与海藻酸钠最终浓度分别为7.5％～10%，0.4%～1.0%；

③将上述混合液用针形管滴入下列溶液中：

 H₃BO₃（饱和溶液） CaCl₂ 1.0％～5.0％  pH值4.0～7.0

④放置10h，使之充分反应；

⑤滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。

利用上述固定化方法，包埋固定化黑曲酶，比较了固定化细胞的活性，结果如表五所示。

 

表五 PVA—H₃BO₃法固定化的比较

 

从表五可以看出，采用方法III，即改进的PVA—H₃BO₃法固定化细胞，其活性明显提高，这是由于在方法III的固定化过程中，引入了少量的海藻酸钠。海藻酸钠作为一种多糖类天然高分子化合物，对微生物细胞器一定的保护作用，减轻了硼酸对微生物的毒性作用，因此提高了固定化细胞的相对活性。

3.2.3 PVA—H₃BO₃法中固定化试剂对细胞活性的影响

（1）    PVA对细胞活性的影响

   一般来说，PVA的浓度对微生物细胞活性的影响不大，即使高达10%时，对细胞活性也没有明显的不良影响。但是，PVA浓度增大，溶液的黏度随之增大，使底物和产物的扩散，尤其是氧气的传递受到影响，进而影响细胞活性。

（2）    H₃BO₃对细胞活性的影响

   硼酸的细胞毒性比较大，因而其对微生物细胞活性的影响是导致PVA—H₃BO₃包埋固定化细胞活性底的主要原因。

4、固定化细胞性能的评价

4.1固定化颗粒的密度

固定化颗粒是指一定体积内固定化颗粒的量， 因此，确定固定化颗粒的密度，也就是测定其体积和重量。但是由于固定化颗粒表面附着着一些水分，它不是固定化颗粒的组分，也无法通过过滤除去，可利用某些特殊溶剂（如葡萄糖）吸收，而这种溶剂不会扩散到固定化颗粒内，该溶剂被稀释的量即为附着的水量。这样，测定固定化颗粒的总量以及附着的水量即可通过计算的出其体积、密度和重量。具体方法此处不再详细叙述。

4.2固定化颗粒的通透性和机械强度

    固定化颗粒的通透性，也称为传质性能，是用来衡量的固定化细胞与外界交换能力的重要指标。通透性越好，固定化细胞与外界的物质交换越容易，固定化微生物对于外界污染物的降解能力越强。

    机械强度，主要衡量固定化颗粒在外界的持续压力冲击下保持形状的能力，一般来说，机械强度越大，颗粒可重复利用率越高，在工程上的应用价值越大。

    但是，通透性和机械强度是一对矛盾。在固定化过程中，固定化时间越长，颗粒的机械强度越大，但是通透性却降低；反之，固定化时间越短，通透性提高，机械强度却无法保证。因此，在实验中应该综合考虑两个因素，在两个指标中寻找最优的组合。

4.3固定化颗粒的最适温度、最适pH值

    固定化后的颗粒，由于在存在状态上与游离的微生物不同，因此在最适温度和最适pH值方面也会有很大的不同。可以通过做对照试验，测出不同组别在不同温度和pH值的条件下降解速率，从而找出最佳的降解的温度和pH值。

    同时可以看到，在固定化以后，微生物可以存在的温度和pH值范围比固定化以前有了显著的扩大。

4.4微生物的包埋量

    由于在制作固定化颗粒的过程中，不可避免的会有一部分微生物没有包埋到颗粒之中，这部分微生物不会参加对污染物的降解，因而在一定程度上会影响降解的效果。 因此包埋量的测定也是评价固定化好坏的一个很重要的指标。

    微生物的包埋量可以通过菌落技术的方法加以测定。

5、固定化微生物的发展趋势

    微生物在自然界中的物质转化和环境净化中起着非常重要的作用，微生物细胞是一个具有多种酶系统的统一体系，其本身就是一种天然的固定化酶反应器，因此利用固定化方法将微生物具体细胞加以固定，则可以用于催化一系列生理生化反应，固定化细胞内的酶体系十分稳定，且不影响其催化活性，具有造作和贮藏的良好稳定性。随着科学技术，尤其是生物工程以及工艺学的发展，开发应用固定化技术处理废水，已经引起国内外专家、学者的重视，并且逐步实现其在工业化生产实践中的应用。

    固定化细胞技术易其特有的优点在废水生物处理领域受到广泛关注，但是还有很多问题亟待解决，未来的主要研究方向主要集中于以下几点：

（1）    固定化载体类型以及包埋方式的研究；

（2）    寻找高效、廉价、抗毒性强的微生物；

（3）    开发多种生物共生的固定化载体；

（4）    开发具有良好流态的固定化反应器；

（5）    协同固定化的研究。

 

 

1、王建龙 生物固定化技术与水污染控制  北京 科学出版社 2002年

2、沈耀良等 固定化微生物污水处理技术 北京 化学工业出版社 2002.5

3、宋吟玲等 硝化细菌固定化细胞的研究   苏州城建环保学院学报 1999.12

4、严小军  细胞固定化的方法和应用  海洋科学  1993.3