一、实验目的：掌握发酵罐的操作技能，学习微生物在发酵罐上发酵的过程和实验方法。

二、仪器

分光光度计、电热恒温水浴锅、生物发酵智能控制系统。

三、试剂

1、DNS试剂：取6.3g3,5-二硝基水杨酸（DNS）和262mL2mol/LNaOH溶液加到酒石酸钾钠的热溶液中（192g酒石酸钾钠溶于500 mL水中），再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌使其溶解，冷却后加水定容至1000mL，保存于棕色瓶中放置7天后使用。

2、10 g/L酪素溶液

3、种子培养基

4、产酶培养基

 

四、实验方法

1、学习发酵罐的使用方法。

2、发酵罐中加入培养基，灭菌。

3、接种、培养。

4、测定酶活:

a. 先将酪素溶液放入（40±0.2）摄氏度恒温水域中，预热5 min；

b. 按下列程序操作：

试管A（空白）   （第二试管）            试管B（酶试样，作三个平行样）（第三试管）

     ↓                                                          ↓

加酶液2.00 mL       （移液管2ml）             加酶液2.00 mL

     ↓（40±0.2℃），2 min                             ↓（40±0.2℃），2 min

加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）（移液管5ml）         加酪素2.00 mL（摇匀）

    ↓（40±0.2℃），10 min                            ↓（40±0.2℃），10 min      

加酪素2.00 mL（摇匀）（移液管2ml）         加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）

↓                                                                  ↓

取出静止10 min，过滤 （第四试管，小漏斗）  取出静止10 min，过滤

↓                                                                  ↓

在275 nm波长下，用 10 mm                   在275 nm波长下，用 10 mm

比色皿测其吸光度                             比色皿测其吸光度

 

（5）计算（=135）

X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E

式中  X——样品的酶活力（u/g）      A——试样溶液的平均吸光度

K——吸光常数（K=135）       8——反应试剂的总体积（mL）

2——吸取酶液2.00 mL，以1 mL计    1/10——反应时间10 min，以1 min计

n——稀释倍数                 E——紫外法与福林法的换算系数（取0.50）

 

五、实验进程安排及结果分析

   （1）第1次实验：在实验老师准备的已灭菌培养基和罐体的前提下，观察罐上接种。同时熟悉罐的结构及每一部件用途。

   （2）第2次实验：在下摇瓶测定发酵液中蛋白酶活力的同时，每位同学在发酵罐上取样，测定发酵液中蛋白酶活力。