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雅致放射毛霉发酵生产蛋白酶的培养基确定



录入时间:2011-8-1 14:27:14 来源:互联网

 
一、实验目的:掌握微生物斜培养基确定方法,学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。
 
二、实验原理:筛选微生物最适生长及产物形成的营养条件和培养条件,以确定特定产物发酵的工艺参数。
 
三、仪器及试剂 :蔗糖,酵母膏,MgSO4等
高压灭菌锅、洁净工作台、恒温振荡培养箱。
 
四、操作方法:
1、种子培养基
2、产酶培养基确定
2.1培养基的配制,各组分别选择以下六种培养基配方:
(1)基础培养基:(100ml)豆粕粉3g,蔗糖0.8g,酵母膏0.1g,MgSO4 0.36g,KH2PO4 0.12g,CaCl2 0.1g。(第一组)
(2)第二组,将基础培养基中蔗糖按成等例葡萄糖;
(3)第三组,将基础培养基中蔗糖按成等例马铃薯淀粉;
(4)第四组,将基础培养基中去掉酵母膏;
(5)第五组,将基础培养基中去掉豆粕粉,并将酵母膏添加量增至0.5%。
(6)第六组,将基础培养基中去掉MgSO4 和CaCl2。
 
2.2培养基灭菌
高压灭菌锅,121℃,20min灭菌。冷却至室温,将上述物品并洗耳球转入超净台,接种前20min进行紫外空气灭菌。
 
2.3接种
冷却到室温开始接种,接种量10%,然后在在28℃、250r/m的条件下培养至发酵液颜色变深、澄清为止。
 
2.4酶活力测定
    根据各组测定酶活结果,比较确定适宜培养基组成。
(1)定义:1 g固体酶粉,在一定温度和pH值条件下,1 min水解酪素产生1 ug酪氨酸为一个酶活单位,以u/g表示。
(2)原理:蛋白酶在一定温度与pH条件下,水解酪素底物,然后加入三氯乙酸终止酶反应,并使未水解的酪素沉淀除去,滤液对紫外光有吸收,可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。
(3)试剂和溶液
① 三氯乙酸(CCl3.COOH)=0.4 mol/L:称取三氯乙酸32.7 g,用水溶解并定容至500 mL
② 磷酸缓冲溶液
③ 100 ug/mL L—酪氨酸标准溶液
④ 10 g/L酪素溶液
⑤ 待测酶液:取1ml发酵液稀释备用。
(4)分析步骤
① 求K值   
② 测定
a. 先将酪素溶液放入(40±0.2)摄氏度恒温水域中,预热5 min;
b. 按下列程序操作:
试管A(空白)   (第二试管)                试管B(酶试样,作三个平行样)(第三试管)
     ↓                                                          ↓
加酶液2.00 mL       (移液管2ml)            加酶液2.00 mL
     ↓(40±0.2℃),2 min                             ↓(40±0.2℃),2 min
加三氯乙酸4.00 mL(摇匀)(移液管5ml)         加酪素2.00 mL(摇匀)
    ↓(40±0.2℃),10 min                            ↓(40±0.2℃),10 min      
加酪素2.00 mL(摇匀)(移液管2ml)         加三氯乙酸4.00 mL(摇匀)
↓                                                                  ↓
取出静止10 min,过滤 (第四试管,小漏斗)  取出静止10 min,过滤
↓                                                                  ↓
在275 nm波长下,用 10 mm                   在275 nm波长下,用 10 mm
比色皿测其吸光度                             比色皿测其吸光度
 
(5)计算(=135)
X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E
式中  X——样品的酶活力(u/g)      A——试样溶液的平均吸光度
K——吸光常数(K=135)       8——反应试剂的总体积(mL)
2——吸取酶液2.00 mL,以1 mL计       1/10——反应时间10 min,以1 min计
n——稀释倍数                 E——紫外法与福林法的换算系数(取0.50)
 
五、实验进程安排及结果分析
   (1)第1次实验:配制培养基,灭菌,等待灭菌时进行发酵罐的上罐观察。
   (2)第2次实验:下摇瓶,测定发酵液中蛋白酶活力,对比各组实验,确定培养基;或从发酵罐上取样,测定发酵液中蛋白酶活力。
 

 

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