1 艰难梭菌简介
艰难梭菌又叫“艰难梭状芽孢杆菌”，最早发现于上世纪30年代，是造成医院感染和住院病患腹泻的常见细菌。普通人群中约有3%的人的肠胃中都有这种细菌，在正常情况下，该细菌受制于人体内的其他细菌，不会危害人体健康。但对于长期或是大量服用抗生素的病人而言，这种细菌是可怕的，甚至是致命的。这是由于药物破坏了人体肠胃中各种菌类之间的平衡，所以容易导致“艰难梭菌”感染。就“艰难梭菌”本身而言，其致命性并不高，在0.6%到1.5%之间，但由于感染该细菌通常会伴随伪膜性结肠炎的出现，一旦出现这种情况，死亡率就会猛增到35%到50%。而且，与所有的细菌一样，“艰难梭菌”会通过突变产生新的变种，而这些变种细菌的毒性和对人体的危害性、致命性通常也更强。
2 艰难梭菌的传统检测方法
所有艰难梭菌菌株皆表达抗原谷氨酸脱氢酶，但是艰难梭菌分为产毒菌株和不产毒菌株两种。仅产毒菌株分泌毒素A和毒素B。毒素A和毒素B都可以导致艰难梭菌相关疾病的发生。艰难梭菌的检测主要是通过对疑似病例的粪便中毒素的检测完成[1]。直接粪便毒素测定包括细胞毒素测定（CTA）和酶免疫测定（EIA）[2]。CTA中毒素B的检测被认为是艰难梭菌检测的金标准[3]。CTA涉及到将培养的细胞暴露到有或者没有抗毒素存在的排泄抽提物中。如果排泄物样本是艰难梭菌阳性，则对没有经过抗毒处理的培养细胞有毒害作用[4]。
艰难梭菌也可以通过在厌氧条件下培养而被检测。这种方法具有很高的灵敏度，但是也很耗费时间，需要超过三天的时间。另外，这种方法不能区分产毒菌株和非产毒菌株。利用EIA对细菌培养分离株进行进一步测试，主要是鉴定艰难梭菌菌株是否产毒 [5]。
传统实验室的C.diff测验都是根据以下三种方法中的一种或者结合几种进行的：细胞培养测定中的细胞毒素检测； 艰难梭菌毒素A、肠毒素、或者毒素A和毒素B的酶免疫测定（EIA）检测； 艰难梭菌的厌氧培养。[6]
2.1 细胞培养测定中的细胞毒素检测
过滤的粪便抽提物加到微量滴定板上处于生长的健康的单层细胞中，培养48h。如果样本中存在细胞毒素（一般是艰难梭菌毒素B），将会导致单层细胞聚集，脱离板（称为细胞病变效应，CPE）。非特定细胞毒素的鉴别是通过加入向第二个孔（孔内有病人的粪便抽提物）加入特定的抗毒素（实际上是培育一种相似的微生物C. sordellii）。只有起始的CPE是由于艰难梭菌毒素B引起的，在相应的孔中抗毒素才会阻止CPE。一般认为，细胞毒素中和（CTN）测定是实验室检测中最灵敏和精确的，但是存在两个主要的缺点：出结果的速度不够快，从而影响了及时的临床诊断；这种方法需要专业的技术和连续的组织培养[7]。
2.2 艰难梭菌毒素A、肠毒素、或毒素A和毒素B的酶免疫测定（EIA）检测
一些商业产品通过检测在主要存在于有生长力的艰难梭菌细胞的一种蛋白质，叫谷氨酸脱氢酶（GDH），结合毒素检测。因为粪便中的毒素易分解，特别是如果在转移到实验室的过程中经过耽误，毒素测验很可能会错误地成阴性，然而GDH是相当稳定的，通常可以表明微生物的存在。这种方法的缺点包括缺乏灵敏性，一些菌株毒素的改变使得不能被商业化产品检测出来；一些无毒素的艰难梭菌也可分泌出GDH（假阳性结果）；一次进行这些检测的费用；如果EIA测验是成批进行以提高工作流程和成本效益，将会使周转时间延长。
2.3 艰难梭菌的厌氧培养
培养是所有检测中最灵敏的方法。但是必须进行二次检测以判断产物毒素是否存在，因为非毒性菌株还是比较常见的。这就延长了出结果的周转时间。另外，艰难梭菌的芽孢是极其坚固的，但是有生长力的形式却比较脆弱，必须维持厌氧环境以使其恢复生长。一种特殊的介质——环丝氨酸-头孢西丁果糖琼胶（CCFA），必须在厌氧环境下储存并培养48h，以达到最佳的恢复。因为培养技术的困难和结果输出的延迟，在相对很少的检测性实验室中会对艰难梭菌进行培养。早先的研究区分疾病通常包括在内镜检查术下宏观观察粘膜的外观，通过组织病理学比较（假膜是由剥落的细胞组成的白色或者黄色粗糙的物质构成），或者在结肠粘膜的活体组织上观察到的的微观病变。目前这种有扩散性的检测在今天已经几乎不被利用了，实验室测验是检测的主要模式。这使得测验和标准的选择至关重要。
最近已经有文献报道了采用两步方法后的更好的结果：对微生物本身非常灵敏的检测，首先利用EIA检测GDH，紧接着对细胞毒素和中和的二次检测。因为在所有病人的粪便标本中的艰难梭菌，对GDH的快速检测将都是阳性的，不管毒素的性质是否已经在运输过程中分解，这种方法是最灵敏的。粪便在其最初的检测中被认为是阴性的，即可立刻被报告时阴性的。因为第一个样本是最有价值的。看护者可以进行其他的检测方法，并使得改变抗生素疗法决定的立即必要性得到阻止。实验室必须继续进行细胞毒素测定，这使得周转时间增加，或者培养和毒素测验的时间增加。然而，两步方法是最有效的。
2.4 传统检测方法面临的困境
无论是CTA还是艰难梭菌培养都需要耗费大量时间和劳动力 。艰难梭菌检测时间的延长将导致拖延对艰难梭菌阳性个体的治疗；鉴定为假阳性可能导致使用抗生素应对个体艰难梭菌感染。这也可能导致个体被误诊为艰难梭菌感染，而与真正艰难梭菌阳性病人共用同一间病房。
目前，一个更加致命的抗氟喹诺酮的限制性核酸内切酶B1族艰难梭菌菌株在世界很多地方已经被越来越多地检测出来[8,9]。这种新型菌株是通过其产物双毒素（CDT）及毒素A和毒素B抑制剂基因位点tcdC的部分缺失加以区别的。
由于与新克隆相关的增加的致病率和死亡率，病菌的检测迫在眉睫，因为甲硝唑的效力逐渐下降，万古霉素应该尽可能地避免使用，甚至新的含益生菌的治疗方法已经流行起来[10,11]。内科医生确实需要一种更加可信和效率的检测。
3 艰难梭菌的快速检测方法
目前市场上有很多艰难梭菌快速检测方法，其中以Meridian Premier C. difficile Toxin A+B ELISA, TechLab Tox A/B Quik Chek, TechLab Toxin A/B II, ImmunoCard Toxin A&B的检测效果相对较好。ImmunoCard Toxin A&B test最大化地缩短了检测时间，整个过程为16-24分钟。另外，这种测验是一个单项测验EIA，可能在临时检测的应用上是实用可行的。其他的快速检测方法需要自动板阅读设备、板清洗机、离心机或者一些消耗品（如不包括在检测试剂盒在内的准备试剂盒等）。大多数的研究都强调，需要更加缜密的方法如CTA或者厌氧培养等，以确认快速检测的结果。另外，快速检测可以用来作为鉴定艰难梭菌阳性个体的初步的筛选方法，可以减少在艰难梭菌感染检测的延误。但是这些快速检测普遍存在灵敏度低和阳性预测值率等缺点[5]。因此，临床上迫切需要一种快速灵敏的艰难梭菌检测方法。
4 艰难梭菌分子生物学检测方法
目前的有研究表明，利用分子学方法进行艰难梭菌检测更有效[12,13]。 Peterson 等评价了real- time PCR检测是利用引物以毒素B基因的一段保守区域为靶点。 由于所有产毒菌株都携带毒素B（有些缺少毒素A），这被视为是产毒菌株的很好的替代标记。
这个研究是分两个阶段进行。第一阶段是将送到实验室的618个艰难梭菌检测标本，进行普通的EIA测验与PCR测验比较。与结合毒素测验的厌氧培养的金标准比较，EIA的灵敏度为67%，精确度为92%，而PCR的灵敏度为94%，准确度为97%。在这个阶段，调查者还设定了一套明确艰难梭菌相关性腹泻诊断的标准，并发现几乎所有真正的CDAD病例每天会有3次或者更多的排便。对符合该标准的采自病人的370个标本，PCR检测的灵敏度比EIA的更高（93% vs. 73%）。real-time PCR和厌氧培养测定皆比酶免疫测定（EIA）更加灵敏(P<.01 to P<.05)。作者总结，与EIA相比，real-time PCR是一个更加灵敏，相对迅速的测验，应该在临床实践中考虑替代用来检测毒性艰难梭菌的酶免疫测定。
目前市场上推出的艰难梭菌快速分子检测有BD GeneOhm real-time PCR test和Cepheid公司的GeneXpert C. difficile快速检测方法等。Stamper等（2009）评价了BD GeneOhm real-time PCR test的检测效果，引用的标准是商业化应用的CTA（Wampole C.difficile Toxin B test）。通过研究表明，GeneOhm的灵敏度为83.6% (95% CI: 74.3% to 92.9%) ，精确度为98.2% (96.8% to 99.6%)，PPV 和NPV分别为 89.5% (81.5% to 97.4%) 、97.1% (95.3% to 98.9%)。整个GeneOhm real-time PCR test大概需要3h，而一般CTA需要24-48h，厌氧培养的时间大约为5天。作者总结认为，GeneOhm是一个快速灵敏的C.difficile分子检测方法[14]。
而Cepheid公司推出的GeneXpert C. difficile快速分子检测，具有更强大的优势。整个检测过程仅需要30分钟。与肉汤富集产毒培养进行比较，其灵敏度为93.5%，精确度为94.0%。与现有的PCR检测、细胞毒素测定、EIA等各种检测方法比较，其具有高度的灵敏度。因此，相比之下，GeneXpert C. difficile检测是一种更加快速、灵敏的检测方法。
参考文献
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