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真菌原生质体制备技术



录入时间:2011-7-12 14:24:02 来源:互联网

 
1.  灭菌物品:
(1)  大滤纸:
(2)  灭菌针筒(含脱脂棉和玻璃钎维)
(3)  脱脂棉
(4)  离心管
(5)  无菌ddH2O
(6)  0.6M MgSO4
(7)  培养基:
A.  等渗培养基(RCM):麦芽汁 1%,酵母膏 1%,蛋白胨 0.4%,葡萄糖 0.4%,pH自然,用0.6M蔗糖配制。
B.  破膜培养基:麦芽汁 1%,酵母膏 1%,蛋白胨 0.4%,葡萄糖 0.4%,pH自然,用水配制。也可以采用含有0.6M蔗糖的PDA作为等渗培养基,破膜培养基不加0.6M蔗糖即可。
(8)  溶壁酶酶液:1.5%,用0.6MMgSO4配制,过滤除菌;
(9)  培养皿:根据样品个数
 
2.  制备方法:
(1)  称取离心管重量并记录;
(2)  用接种针挑出菌丝,并用灭菌双蒸水冲洗一次,然后用无菌的0.6M MgSO4冲洗两次,用灭菌的滤纸吸干,放入已知重量的离心管,称重并记录;
(3)  计算得到菌丝重量,按0.2(g):1(mL)加入灭菌酶液,震荡均匀;
(4)  28℃,3~4小时,摇床震荡(轻微),酶解,同时每30min镜检观察原生质体数量;
(5)  灭菌注射器(含脱脂棉和玻璃钎维)过滤;
(6)  离心:2500rpm,2min
(7)  用0.6M MgSO4洗涤沉淀3次;
(8)  用用0.6M MgSO4定容至最初的加酶量;
(9)  镜检计数;记录;
(10)  涂板后再生培养,第7天后每隔1天计数一次

 

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