一、实验目的与要求：
（1） 熟悉玻璃器皿的洗涤包装和灭菌前的准备工作。
（2） 学习微生物培养基和无菌水的制备，了解培养基配方中各成分的作用、制备流程及各环节的操作技术与应用。
（3） 学习并掌握培养基的高压蒸气灭菌原理、操作关键技术和灭菌技术。
二、实验原理
培养基的制备原理
培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异。但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。
根据制备培养基对所选用的营养物质的来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基三类。按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。根据培养基使用目的，可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等。
培养基的类型和种类是多种多样的，必须根据不同的微生物和不同的目的进行选择配制，本实验分别配制常用培养细菌、放线菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基等固体培养基。
固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化。琼脂在95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内(25℃-37℃)不会融化而保持固体状态。
高压蒸气灭菌原理
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低(表Ⅴ-2)，二是湿热的穿透力比干热大(表Ⅴ-3)；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
表Ⅴ-2 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系
|
卵自蛋白含水量(%) |
30分钟内凝固所需温度(℃) |
|
50
25
18
6
0 |
56
74-80
80-90
145
160-170 |
表Ⅴ-3 干热与湿热穿透力及灭菌效果比较
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温 度 (℃) |
时间(小时) |
透过布层的温度(℃) |
灭 菌 |
|
20层 |
40层 |
100层 |
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干热 130-140 |
4 |
86 |
72 |
70.5 |
不完全 |
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湿热 105.3 |
3 |
10l |
10l |
10l |
完 全 |
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表Ⅴ-4。一般培养基用1.05kg/cm2，121.3℃ 15-30分钟可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.56kg/cm2(8磅/英寸2)，112.6℃灭菌15分钟，但为了保证效果，可将其他成分先行121.3℃，20分钟灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20分钟即可，而盛于大瓶内的培养基最好以1.05kg/cm2灭菌30分钟。
表Ⅴ-4灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系
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压 力 数 |
全部空气排出时的温度 (℃) |
2/3空气排出时的温度(℃) |
l/2空气排出时的温度 (℃) |
1/3空气排出时的温度 (℃) |
空气全不排出时的温度 (℃) |
|
千克
(公斤/ 厘米2)
(kg/cm2) |
磅/英寸2
(1b/in2) |
|
0.35
0.70
1.05
1.40
1.75
2.10 |
5
10
15
20
25
30 |
108.8
115.6
121.3
126.2
130.0
134.6 |
100
109
115
121
126
130 |
94
105
112
118
124
128 |
90
100
109
115
121
126 |
72
90
100
109
115
121 |
蒸汽压力所用单位为kg/cm2(千克/厘米2)，它与1b/in2(磅/英寸2)和温度的换算关系见表Ⅴ-5。
表Ⅴ-5 蒸汽压力与蒸汽温度换算关系
|
蒸汽压力
大气压 |
压 力 表 读 数 |
蒸汽温度 |
|
kg/cm2 |
1b/in2 |
|
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.50
3.00 |
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.50
2.00 |
0.00
3.75
7.50
11.25
15.00
22.50
30.00 |
100.0
107.0
112.0
115.0
121.0
128.0
134.5 |
三、实验器材
1、 药品琼脂，10％HCL,10% NaOH，牛肉膏蛋白胨培养基的配方药品；
2、 材料具刻度1000毫升塘瓷盅或小铝锅，电子称，10×200mm试管，量筒，小烧杯，玻璃棒，骨匙，pH试纸，分装漏斗，试管盒，纱布，棉花，报纸，麻绳，标签，培养皿。
3、 设备高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等
四、实验步骤
1、 称取药品放在大烧杯中，加入蒸馏水用玻璃棒搅拌并加热溶化，等药品溶解后用pH试纸调节p H至7.4-7.6，如有沉淀应过滤后分装，每支试管约加入9ml。每组分装30支，加上棉塞，包上牛皮纸，准备灭菌。
装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、以免弄湿棉塞，造成污染。
2、无菌水准备
在试管或瓶内先盛以适量的蒸馏水〔或生理盐水O．85％NaCl)，盖好棉塞，包上牛皮纸使其灭菌后，其水量恰为9ml。 每组准备10支与牛肉膏蛋白胨培养基可放在同一试管架上，以一大张牛皮纸包扎写上姓名。准备灭菌。
3、高压灭菌
手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤：
（1）首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
（2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
（4）用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除涡内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1.05kg/cm2，121.3℃，20分钟灭菌。
（5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。
（6）将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。
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