1.实验目的和要求 

 

（1）通过对周围环境中微生物的观察，理解无菌操作原理，了解微生物的普遍存在性。

（2）通过从土壤中分离纯化微生物，掌握无菌操作技术。

 

2.实验材料和仪器

 

2.1配制肉汤蛋白胨固体培养基平板（每组15个）

 

（1）牛肉膏5g；

（2）蛋白胨10g；

（3）NaCl 5g；

（4）琼脂20g；

（5）自来水1000mL pH 7.5，0.1MPa，121℃来菌20min。

 

2.2无菌生理盐水

 

（1）250mL三角瓶中加入99mL 0.9% NaCl （加20个左右的玻璃珠）；

（2）250mL三角瓶中加入50mL 0.9% NaCl （作10倍稀释用）。

 

2.3仪器及器皿

 

（1）带螺帽试管5支；

（2）牙签2支；

（3）5mL及1mL吸头2支；

（4）涂布棒2支；

（5）5mL及1mL取液器各一支；

（6）30℃和37℃培养箱；

（7）接种环、酒精灯和火柴；

（8）摇床。

 

（1）-（4）要求事先灭菌。

 

3.实验方法和步骤

3.1从土壤中分离和纯化微生物

 

（1）采土样

     选择较肥沃的土壤，铲去表土层，挖5-20cm深度的或特殊要求的地方土壤数10g，装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实验室供分离用。

 

（2）制备土壤稀释液

     称取土样1.0g放入盛99mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土样均匀分散在稀释液中成为土壤悬液（10-2）。用1mL的无菌吸头从中吸取0.5mL土壤悬液注入盛有4.5mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀（10-3）。然后再用同一支1mL吸头，从此管中吸取0.5mL注入另一盛有4.5mL无菌水的试管中（10-4），依此类推制成10-5，10-6，10-7各种稀释度的土壤溶液。

 

3.2涂布

   用一支1mL无菌吸头分别从稀释度10-7、10-6和10-5的土壤稀释液中各吸取0.1mL对号放入已写好稀释度的肉汤蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做3个平板。

 

3.3培养

   将平板倒置于37℃温箱中培养48h。统计每个平板长出的平均菌落数。根据下面菌落计数方法，算出每克土壤中的细菌含量。

 

3.4菌落计数方法

   先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片菌苔生长时，则不应使用，而应以无片状菌苔生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，可将此一半的菌落数乘2以代表全部平皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。

   首先选择平均菌落数为30～300的平板，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数即为该样品中的微生物总数。

   若有两个稀释度的平均菌落数为30～300，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数:

   若大于2，则取其中较少的菌落总数。

   若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。

   若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。

   若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数。