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微生物的保存技术(2)



录入时间:2011-6-28 14:24:11 来源:互联网

 
2   病毒的超低温保存法 
 
2.1   一般概念 
 
         大多数微生物可用超低温保存,超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。 需要复杂营养的微生物种,如用其他的贮存方法不能保持其活力(如植物的病原性真 菌) ,通常可用超低温的方法保存(ATCC  1983;Halliday,Baker  1985) 。
        此法是将冻存 在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率(1℃/分钟)冷冻,直至—150℃,再将这些小管 贮存在—150~-196℃的液氮中。 超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC 常用一种由甘油(10%) 、二甲亚砜(5%)和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时,所形成的冰晶会将细胞杀死,正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失,做法是:将封口的小管迅速放入 37℃的水中,直至所有的冰融化,然后打开管口,将内容物移入培养基。超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中,因此需要液氮罐。在长期贮存 的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费,包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。 
 
2.2    材料 
 
病毒超低温保存所需材料有:热收缩塑料管(Nunc Cryoflex) ,液氮罐,防护手套和面罩,永久性记号笔,气体喷灯,装液氮的保温瓶。 
 
2.3   方法 
 
(1)剪一段两端各超出冷冻管长度 2cm 的热收缩塑料管。 
(2)将含有澄清病毒悬液(组织培养的上清培养基,或组织培养基内的细胞溶解产物均可)冰浴几分钟,用灭菌移液管将 0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内,并将盖子拧紧。 
(3)将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部,插入正确的标签。 
(4)用喷灯小心加热热收缩塑料管,并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。 
(5)再小心加热热收缩塑料管的两端,用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。 
(6)将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻(操作时要求戴面罩和手套) 。 
(7)将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内,同时记录样品的详细的存放位置、实验编号和存放日期等。 
(8)需要用时,迅速从液氮罐内取出所需样品,并投入 37℃水浴箱中解冻后,用解剖刀片在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。拧开冷冻管的盖子时不需要除去热收缩塑料管。 
 
3    低温保存法 
 
3.1   材料 
 
(1)培养基: 
2 号营养肉汤粉(Unipath)             2.5g 
甘油(Sigma)                                  15ml 
蒸馏水                                                  85ml 
将上述材料混匀后,分装在 5ml 瓶内,在 121℃下灭菌 15 分钟。 
(2)厌氧菌用 BGP 培养基〔其中不加琼脂,而加 15%(体积比)甘油〕 : 
胰蛋白胨(Unipath)             1.0g 
氯化钠                                       0.5g 
牛肉提取物                               0.3g 
酵母提取物                               0.5g 
盐酸半胱氨酸                           0.04g 
葡萄糖                                       0.1g 
磷酸氢二钠                                0.4g   
甘油                                          15ml 
蒸馏水                                       85ml 
将上述材料混匀后,分装在 10ml 瓶内,在 121℃下消毒 15 分钟。以上两种培养基使用前均能在 4℃环境中存放几个月。 
(3)玻璃珠:将直径为 2mm 的玻璃珠(Creative  Beadcraft  Ltd;mersham,Buckinghamshire,UK)按上述冻干法中的清洗法清洗。 
(4)冷冻管:在 2ml有盖冷冻管(Nunc,Paisley,Scotland)内存放 20~30 粒清洗好的玻璃珠,盖好盖后置 121℃下消毒 15 分钟。消毒过的冷冻管可在室温下保存。 
        此外,将超低温冰箱预先冷却到—70℃,灭菌塑料加样头。 
 
3.2   方法 
 
(1)用非选择性固体培养基(如营养琼脂或血琼脂)在适宜细菌生长的条件下培养细菌。 
(2)无菌条件下加 2ml 细菌悬浮液至营养肉汤中。 
(3)用一支无菌的塑料环将细菌和肉汤混匀(细菌的最终浓度为 108~1010 个细胞/ml) 。 
(4)按冻干法在无菌条件下将细菌分装到有灭菌玻璃珠的冷冻管内,反复吹打几次,使珠子内部的气泡完全被细菌悬浮液所替代。 
(5)吸去冷冻管内多余的液体。 
(6)将混有细菌和珠子的冷冻管放在架子(Jencons Scientific Ltd,Leighton,Buzzard,Bedfordshire,UK)上,然后将架子放入—70℃的冰柜内。 
(7)从冰柜中取出一支冷冻管,在无菌条件下打开,用灭菌镊子从管中取出一粒珠子,然后迅速将管子放回冰柜,以免管子内的其余珠子融解。 
(8)直接将珠子接种到固体培养基上或液体培养基中,在适当的条件下培养。 
 

 

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