一、目的和要求 

 

1. 了解管碟法的原理。

 

2. 掌握二剂量法测定抗生素效价单位的技术和计算方法。

 

二、原理

 

抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。

 

当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。

 

三、实验材料

 

1. 四环素类抗生素的标准品和样品。

 

2. 试验菌：藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）。

 

3. 培养基：250ml三角瓶分装150ml LB琼脂，150ml三角瓶分装50ml LB琼脂，50ml三角瓶分装20ml藤黄八叠球菌悬液用培养液。

 

4. 灭菌物品：培养皿，牛津杯（内径：6.0±0.1mm，外径：7.8±0.1mm，高度：10.0±0.1mm），滴管，1ml吸管，pH6.0的磷酸缓冲液，弯头镊子，15×150mm试管，瓦盖。

 

5. 其它：分析天平，容量瓶，玻璃板，水平仪，游标卡尺。

 

四、实验实施

 

1. 配制标准品溶液

 

2. 配制样品溶液

 

3. 制备菌悬液。

 

4. 制备平板：

 

（1）取6套无菌培养皿，分别加入约20mlLB培养基后，置水平玻璃板上凝固，作为底层。

 

（2）另取冷却至50℃左右的50ml LB培养基，加入1ml试验菌悬液，迅速摇匀后，用10ml破口吸管取6ml混菌培养基倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。

 

5. 在培养基平板底部作好相应标记，用弯头镊子在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯。

 

6. 用滴管分别将高、低浓度的标准品和样品溶液加入到牛津杯中，以滴满为度，换上皿盖。

 

7. 将培养皿平稳送入恒温箱，37℃下培养16～18h。

 

8. 用游标卡尺测量抑菌圈直径