1试剂盒回收 (离心法)
(1) 在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量,该重量作为一个凝胶体积(如1oomg=1ooul)
(2) 根据凝胶的浓度,加DE-A 液
凝胶浓度 DE-A溶液体积
≤1.0% 3个凝胶体积
≤1.5% 4 个凝胶体积
≤2.0% 5 个凝胶体积
混匀后于75℃加热,(低熔点琼脂糖凝胶于45℃加热),间断混合,直到凝胶熔化(6-8分钟).
(3)加0.5个DE-A体积的DE-B溶液,混匀(是否需调整PH值,见注意事项1);当分离的DNA片段小与400bp 时,加入异丙醇至终浓度为20%;
(4)吸3中的混合液,转移到DNA制备管,3600rpm离心1分钟.如制备管中有残留,适当提高速度,再离心1分钟,去滤液;
(5)将制备管置回离心管,加0.5ml W1溶液,3600rpm离心30,弃滤液;
(6)将制备管置回离心管,加0.7ml W2溶液,3600rpm离心30,弃滤液,重复一次; （W2中含有酒精，应保证瓶子密封。）
(7)将制备管置回离心管,最高速度离心1分钟;
(8)将制备管置洁净的1.5 ml 离心管中,在DNA制备膜正中央加25ul水或洗脱液,室温静置1分钟.最高速度离心1分钟洗脱DNA.
注意事项;
1.此法适合从TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收DNA,用其他缓冲液时,加DE-B溶液后,溶液的PH要调整到6.5以下.
2. 勿将DNA长时间暴露在高温下,线型DNA于高温条件下易水解.勿将凝胶长时间暴露在紫外灯,减少紫外灯对DNA的损伤.
3. 2步骤中的凝胶必须完全熔化,否则将严重影响DNA的回收效率.
4. 步骤4中吸回滤液到DNA制备管中再吸附一次,可提高回收效率.将洗脱液或水加热到60℃,可提高回收效率。（重要）
5. DNA分子呈酸性,建议在洗脱液中保存。（试剂盒中提供的洗脱液好像对PCR有某种抑制作用。）
2 silica回收
1 在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶, 用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量;
2. 加入2-3倍体积的6M KI或NaI（避光4度保存）;
1. 65℃温浴, 间断混合,直到凝胶熔化;
2. 加适量的振匀的silica悬液（10ul）充分混匀, 冰上放置15分钟（或更长）,间断混合;
3. 5000rpm离心3分钟, 弃上清;
4. 加1ml预冷的NEW buffer（先用100ul打散沉淀，再用900ul混匀），冰上 洗盐2 分钟，间断混合;
5. 12000 rpm离心10s, 弃上清;
6. 重复6,7步骤1次;
7. 于50℃烘箱烘干;
8. 加10ul的去离子水用枪头打匀,65℃水浴15分钟,间断混匀;
9. 12000 rpm离心10 s，把上清转移到另外洁净的离心管中;
10. 跑胶检测回收效率.
注意事项
＊ 4----8步均在冰上操作，防止解吸附，silica只在低温下对DNA有吸附作用。
＊ NEW Buffer：（100ml）
1ml 5M Nacl, 1ml 1M pH7.5 This-HCl, 0.5ml 0.5M EDTA, 50ml 100% ETOH, 去离子水加至100ml。（-20度保存）
＊ Silica配法见：TIG January 1995 Vol.11 No. 1. An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purifyication.
上一篇：大肠杆菌质粒的抽提
下一篇：大肠杆菌DNA纯化
