【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果通过查阅《伯杰氏系统细菌学手册》对照种属特征最终判断所分离纯化的细菌所属的属。

 

【abstract】By several methods and technique, we got the pure cultures of two kinds of bacteria which were separated from soil. According to the results of colony observing, staining, and experiments of physiology and bio-chemistry, we referred to the Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology and finally decided their genus.

 

【关键词】革兰氏阳性、芽孢、片球菌属 、 芽孢杆菌属

实验目的：

1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。

2、学习、掌握微生物的鉴定方法。

3、对提取的土样进行微生物的分离、纯化培养，并进行简单的形态鉴定。

4、对简单鉴定后的微生物进行生理生化鉴定并由鉴定结果查伯杰氏手册以确定分离出微生物的品种。

 

实验原理：

    从复杂的微生物群体中获得只含有一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有

1、简单单细胞挑取法         

2、平板分离法

此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化。其原理包括两方面：

1、在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、酸碱度、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

2、微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成。

    但是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落的特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。有的微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化的到许多有价值的菌株。此实验将从土壤中分离两种细菌。

 

实验器材、试剂与菌种：

1、器材：

培养皿、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、电炉、玻璃棒、接种环、镊子、搪瓷杯、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪（枪头）、电子天平、滤纸、pH试纸等。

2、 试剂：

配制牛肉膏蛋白胨培养基的原料（牛肉膏、NaCl、琼脂、蛋白胨）、配置糖发酵培养基的原料（葡萄糖、K2HPO3、溴百里酚蓝、琼脂、NaCl、蛋白胨）、甘油（丙三醇）、结晶紫染液、番红染液、碘液、95％乙醇、5％孔雀绿染液、0.5％番红水染液、3％过氧化氢水溶液、1％盐酸二甲基对苯撑二胺溶液、蒸馏水等。

3、 土样：取自山东大学7号宿舍楼门前土壤，地下10cm左右。

 

实验步骤：

1、配制牛肉膏蛋白胨培养基：

1）配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基500ml （用于12个平皿和10支试管斜面）

         牛肉膏 0.3% ………………………………… 1.5 g

         蛋白胨 1% ……………………………………  5g

         NaCl  0.5%  ………………………………… 2.5g

         琼脂   2% …………………………………… 10g

         pH  …………………………………………  7.0~7.2        

2）倒12个平板和10支试管斜面，包扎，121℃灭菌20min.

2、制备土壤稀释液：

称取土样10g，放入盛有100ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀10min 使土和水充分混合，然后用移液枪从三角瓶中吸取1ml（此操作要求无菌操作），加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推分别制成制成0.01、0.001、0.0001不同稀释度的土壤溶液。

3、涂布培养：

以0.01以及0.0001两个浓度的土壤稀释液作为涂布平板培养的对象，将其分别涂布在3个牛肉膏蛋白胨培养基中，共6个培养基，标号，37°C温箱培养48 h。

4、划线分离（划线培养）：

对两种土壤溶液的微生物培养基进行观察，记录两种区分明显的细菌性状。挑取此两种细菌在新的培养基中划线培养（每种细菌培养3个培养皿），标号、37°C培养。

  5、初步鉴定：

对两种菌进行简单染色、革兰氏染色以及芽孢染色观察，记录结果。

6、试管斜面再培养：

      将两种纯菌株接种分别接种在5支试管中，共10支试管。37°C培养（18－24h）。

7、对试管中培养的两种菌进行生理生化鉴定：

   1）过氧化氢酶鉴定：

     A 实验原理：

乳酸菌与许多厌氧菌与其他细菌区分的主要依据是鉴定有无过氧化氢酶。该酶可以把过氧化氢分解为水与氧气，气体氧以气泡跑出来，则为过氧化氢酶实验阳性。乳酸菌和许多厌氧菌在过氧化氢酶实验中呈现阴性。

     B 步骤：

将培养新鲜的待测菌种（培养18－24h内）接在载玻片上，滴一滴3％过氧化氢于菌体上。

   2）糖发酵与氧化实验

      A 实验原理：

在细菌的分类鉴定中，糖发酵与氧化测定是一项重要的依据。绝大多数细菌都可以利用糖类作为能源以及碳源，但由于不同的菌存在酶系的差异，因而对糖类的发酵与氧化的能力就有所不同。有的在糖类发酵与氧化代谢中能分解糖类，产酸产气，有的则只能产酸不可以产气。酸的产生与否，以及是发酵型产酸还是氧化型产酸，可以由预先加在培养基中的指示剂（溴百里酚蓝水溶液）呈现出来。这样把接好菌种的培养基放在厌氧或好氧的环境下培养，培养基有绿色变为黄色为产酸，是否产气是通过观察培养基中是否产生气泡或培养基断裂来测定。

      B 步骤

       ① 配置糖发酵培养基150 ml （葡萄糖：、K2HPO3：、溴百里酚蓝、琼脂：、NaCl：、蛋白胨：），分装试管。

       ② 110°C灭菌培养基20 mins （同时灭菌一定量甘油，待用）。

       ③ 对两种细菌进行“穿刺”培养，每种菌做5个试管：2个盖管培养，2个开管培养，一个为盖管对照组。在培养基的上方加入1－2cm厚的甘油，作为“盖  管”，以提供菌体无氧的生长环境，开管则不加甘油，作为有氧的生长环境供菌体生长。

④ 在37°C下培养，并在培养24h后观察培养基中颜色的变化，以及有无气泡。

    3）细胞色素氧化酶测定

       A 实验原理

    细胞色素氧化酶是氧化酶的一种，它在有分子氧以及细胞色素C存在时，可以氧化二甲基对苯撑二胺，使之呈现玫瑰红或暗红色，在此基础上还可以与a－苯酚结合生成吲哚酚兰，出现蓝色

       B 步骤

     在干净培养皿中放一滤纸，用火柴棒取培养18－24h的鉴定菌苔黏在滤纸上，滴一滴1％盐酸二甲基对苯撑二胺溶液于菌苔上，进行观察。