三、制片和染色的基本程序

 

　　微生物的染色方法很多，各种方法应用的染料也不尽相同，但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序。

 

1、制片

 

　　在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水，用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层，为避免因菌数过多聚成集团，不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层，若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液，则直接涂布于载玻片上即可。

 

2、自然干燥

 

　　涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

 

3、固定

 

　　标本干燥后即进行固定，固定的目的有三个：

 

　　１）杀死微生物，固定细胞结构。

 

　　２）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。

 

　　３）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。

 

　　固定常常利用高温，手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3—4次，共约2—3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。

 

　　以上这种固定法在微生物实验室中虽然应用较多普遍，但是应当指出，在研究微生物细胞结构时不适用，应采用化学固定法。化学固定法最常用的固定剂有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1—2%的饿酸等。饿酸能很快固定细胞但不改变其结构，故较常用。应用饿酸固定细胞的技术如下：在培养皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛细管，在毛细管中注入少量的1—2%饿酸溶液，同时在玻璃上再放置湿标本涂片的载玻片，然后把培养皿盖上，经过1—2分钟后把标本从培养皿中取出，并使之干燥。

 

4、染色

 

　　标本固定后，滴加染色液。染色的时间各不相同，视标本与染料的性质而定，有时染色时还要加热。染料作用标本的时间平均约1—3分钟，而所有的染色时间内，整个涂片（或有标本的部分）应该浸在染料之中。

 

　　若作复合染色，在媒染处理时，媒染剂与染料形成不溶性化合物，可增加染料和细菌的亲和力。一般固定后媒染，但也可以结合固定或染色同时进行。

 

5、脱色

 

　　用醇类或酸类处理染色的细胞，使之脱色。可检查染料与细胞结合的稳定程度，鉴别不同种类的细菌。常用的脱色剂是95%酒精和3%盐酸溶液。

 

6、复染

 

　　脱色后再用一种染色剂进行染色，与不被脱色部位形成鲜明的对照，便于观察。革氏染色在酒精脱色后用番红，石碳酸复红最后进行染色，就是复染。

 

7、水洗

 

　　染色到一定的时候，用细小的水流从标本的背面把多余的染料冲洗掉，被菌体吸附的染料则保留。

 

8、干燥

 

　　着色标本洗净后，将标本晾干，或用吸水纸把多余的水吸去，然后晾干或微热烘干，用吸水纸时，切勿使载玻片翻转，以免将菌体擦掉。

 

9、镜检

 

　　干燥后的标本可用显微镜观察。

 

　　综上所述，染色的基本程序如下：