食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。

 

 

    一、无菌操作要求

    1. 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。

    2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。

    3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。

    4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。

    5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。

    6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。

    7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。

    8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。

 

    二、无菌间使用要求

    1. 无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。

    2. 无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。

    3. 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。

    4. 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。

    5. 在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置

 

    三、消毒灭菌要求

    微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。

 

   （一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法

    1．灭菌前准备

   （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。

   （2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。

    2．装放

   （1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。

   （2）大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。

    3．设备检查

   （1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。

   （2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。

   （3）对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。

    4．灭菌处理

    (1) 干热灭菌法：此法适应于在干热情况下，不损坏、不变质、不蒸发的物品、较常用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。

      ① 器械器皿应清洗后再干烤，以防附着在表面的污物炭化。

      ② 灭菌时安放物品不能过挤，不要直接接触底和箱壁，物品之间留有空隙。

      ③ 菌时将箱门关紧，接上电源，先将排气孔打开约30min，排除灭菌器中的冷空气，温度升至160℃调节指示灯，维持1.5 –2h。

      ④ 灭菌完毕后或温度升温过程中，须在60℃以下才能打开箱门。

   (2) 手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：

     ① 手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需更换）.

     ② 手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。

     ③ 盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气（水沸腾后排气10-15min）。

     ④ 关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。

     ⑤ 达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下 再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。

   (3) 卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行：

    ① 关紧锅门，打开进气阀，将蒸气引入夹层进行预热，夹层内冷空气经阻气器自动排出。

    ② 夹层达到预定温度后，打开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。

    ③ 待锅室达到规定的压力与温度时，调节进气阀，使保持恒定至

    ④ 自然或人工降温至60℃再开门取物，不得使用快速排出蒸气法，以防突然降压，液体剧烈沸腾或容器爆破。

    ⑤ 使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应根据物品类别按动相应开关，以便按要求程序自动进行灭菌，灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查，操作要求应严格按照厂家说明书进行。

    5．灭菌温度与时间(1) 干热灭菌器灭菌温度160℃，1.5-2h。(2) 压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间

 

   （二）间歇灭菌方法

    1.灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此法灭菌。

    （1）将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。

    （2）关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10～20min。

    （3）灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。

    2．血清凝固器使用方法，培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时，因高热会破坏其营养成份，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。

    (1) 在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后使用。

    (2)将培养基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75～90℃1h灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌三次。

    3．煮沸消毒：可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15 min，也可在水中加入2﹪石炭酸煮沸5 min，加入0.02﹪甲醛, 80℃煮60 min均可达到灭菌目的, 但选用煮沸消毒的增消剂时, 应注意对物品的腐蚀性.

    4．灭菌处理:灭菌后物品,按正常情况已属无菌,从灭菌器中取出应仔细检查放置,以免再度污染。

    (1) 物品取出,随即检查包装的完整性,若有破坏或棉塞脱掉,不可作为无菌物品使用。

    (2) 取出的物品,如为包装有明显的水浸者,不可作为无菌物品使用。

    (3) 培养基或试剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。

    (4) 启闭式容器,在取出时应将筛孔关闭。

    (5) 取出的物品掉落在地或误放不洁这处,或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无菌物品使用。

    (6) 取出的合格灭菌物品,应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放。

    (7) 凡属合格物品,应标有灭菌日期及有效期限。

    (8) 每批灭菌处理完成后,记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。