纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，它能被土壤中某些微生物分解利用，是因为它们能够产生纤维素酶。本实验通过从土壤中分离分解纤维素的微生物，初步鉴定了其形态特征和生理生化特性，为日后更进一步的研究打下基础。

一:实验原理

1.纤维素与纤维素酶

纤维素与淀粉都是由葡萄糖组成的，但组成两者的葡萄糖的连接方式不同，因而使两者的形态完全不同。纤维素是由葡萄糖分子按β-1,4糖苷键连接而成的，淀粉是由葡萄糖分子按α-1,4糖苷键连接而成的。

人类以淀粉为主要能量来源，但完全不能消化纤维素，而反刍动物和大量的微生物则主要以纤维素为能量来源。这是因为，在反刍动物的瘤胃中生活着大量的可以分解纤维素的微生物。微生物产生的纤维素酶是一种复合酶，包括内切酶（Cx酶）、外切酶（C1酶）和葡萄糖苷酶。内切酶作用于无定型的纤维素区域，使纤维素断裂成片段；外切酶又叫纤维二糖水解酶，它可以作用于纤维素的结晶区或小片段纤维素，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖分子，产生纤维二糖；葡萄糖苷酶则将纤维二糖分解成葡萄糖。

 

2.两种刚果红染色法的比较

刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20年的历史，在本课题中我们给出了两种方法。方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

 

二．实验流程

1．土样的采集

土壤中的微生物，大约70%~90%是细菌。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约3~8cm的土壤层。因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。另外，土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。综合各种因素，本小组从图书馆后院的落叶堆积丛取土样。

2．选择培养_富集培养

在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前，先通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。

富集培养所需要的仪器有：250ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、玻璃珠、称量纸等。

 

选择培养基的制备比例见下：

 

纤维素分解菌的选择培养基

纤维素粉             5g

NaNO3               1g

Na2HPO4•7H2O       0.5g

KH2PO4                0.9g

MgSO4•7H2O          0.5g

KCl                  0.5g

酵母膏               0.5g

水解酪素             0.5g

将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml

按上表比例配制50ml选择培养基。在250ml锥形瓶中装入50ml培养基，放5~6颗玻璃珠，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层牛皮纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

称取土样20g，在无菌条件下加入装有50ml培养基的锥形瓶中。将瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养3~4d，至培养基变浑浊。

 

3.梯度稀释

用量程为1000µL的移液管从富集培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。然后从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释度的土壤溶液。

 

4.刚果红染色法分离（涂布平板）

（1）鉴别培养基的制备

培养基的制备比例如下：

鉴别纤维素分解菌的培养基

CMC-Na             5-10g

酵母膏               1g

KH2PO4              0.25g

琼脂                 15g

土豆汁                100ml

将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml

按以上比例配制200ml鉴别培养基和10mg/ml的刚果红（CR）溶液，灭菌后，按照每200ml培养基加入1ml的比例往培养基中加入CR溶液，混匀后倒平板，凝固后待用。

 

涂布平板

将上述已倒培养基的十个平板底面分别用记号笔写上10-4,10-5,10-6三种稀释度（每个稀释度写3个）和一个空白平板（留作对照用）。然后用移液器分别由10-4,10-5,10-6三管土壤稀释液中各吸取0.1ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。30℃倒置培养，至菌落长出，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。