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    真菌检验技术的进步



    录入时间:2011-5-16 9:48:25 来源:中华检验医学网

    真菌检验的临床重要性日益增加。传统的真菌培养和鉴定技术需时较长,且深圳特区部真菌感染的病原菌常不易培养成功,成为实验诊断的难点。
          近年来,真菌感染的快速实验诊断技术正在努力解决这一问题。一、应用分子生物学技术自临床标本中检出真菌DNA;二、应用单抗和免疫学技术自临床标本中快速检出真菌抗原;三、利用真菌的特异性酶快速诊断真菌;四、常规培养与鉴定技术的进步,现分述如下。
     
    一、 常规分离、鉴定技术的进步
          利用酵母样真菌在生长过程中形成的酶,作用于培养基中的色原底物,使菌落呈现不同的颜色,此种CHROMO AGAR的应用,利于快速分离与初步鉴定酵母样真菌。
          酵母菌的常用鉴定系统已有以AP120C为代表的手工法,以ATB32C为代表的半自动法,以AMS(vitek,vitek 2)为代表的自动代法借助于AMS的YBC卡的生化反应,应用人工双歧层次分析鉴定法(Dendrogram Hierarchy Process Analytic identification Method,DHPA)可使鉴定正确率提高。
          利用酵母菌生长过程中形成的予成酶(Preformed Enzymes)作用于合成的色原底物而制成的成套微量鉴定系统Rap ID Yeast plus System(RYP,美国Innovative Diagnostic System公司),可于4小时完成酵母菌的快速鉴定,与应用API20C的一致率达97.3%。
          平滑念株菌可利用其快速分解菌藻糖(Trehalose)而迅速鉴定。用4%菌藻糖的0.1μmol/L枸橼酸缓冲液,取待鉴定菌落浓涂入液中,37℃温育3h,以尿葡萄糖试纸检测,如在2分钟内显色(阳性)即为平滑念珠菌。经与传统鉴定方法比较,此法的敏感性98.8%,特异性99.1%.
          都柏林念珠菌的临床重要性在增长,其简易可靠的鉴定试验为该菌在42℃不能生长,且β-D葡萄苷酶为阴性。
    二、 自临床标本中直接检查抗原
          深部真菌感染者血中难于培养出菌体,尤其是丝状真菌菌体常粘附、缠绕于组织,血中不易出现。但组织中菌体可溶性抗原可吸收入血自血、尿或感染组织液中直接检查真菌抗原为快速诊断的重要手段;虽也可检查抗体,但难达快速诊断。
    (一)、检测念球菌属的甘露聚糖及其抗原
    1.胶乳凝集试验(Sanofi Diagnostics Pasteur公司)
    取300μl血清,加100μlEDTA处理液,混匀,煮沸3min,离心10000×g10min,取上清40μl加10μlSanofi胶乳粒子,3min内出现凝集为阳性。
    2. EIA法。以单抗包被酶标板,用双抗体夹心法检查血清中念球菌抗原(Behring Diagrostics公司试剂)
    3.检测血中的白色念球菌的甘露聚糖抗体。ENA法检查中甘露聚糖对念珠菌感染的诊断敏感性40%,特异性98%,ENA法检查甘露聚糖抗体对念珠菌感染的诊断敏感性53%,特异性94%。
    4.检查血清中D-阿拉醇或D-阿拉伯醇与L-阿拉伯醇的比值可快速诊断念珠菌病。Yeo等用基因重组的D-阿拉伯醇脱氢酶以酶荧光法定量,发现念珠菌感染者血清中来自菌体的D-阿拉伯醇明显升高,用此法迅速论断新生儿的侵袭性念珠菌病。
    Mitsutake等比较了自39名深部念珠菌病患者血液中检出抗原的四种方法。应用斑点印迹法检查其烯醇化酶(Enlase)抗原的阳性率71.8%,特异性100%;应用胶乳凝集检查热敏性糖蛋白抗原阳性率76.9%,特异性87.5%;应用胶乳凝集检查甘聚糖抗原阳性率75.6%,特异性100%,应用鲎试试验检查细胞壁组分β-Glucan的阳性率84.4%,特异性87.5%。
    (二)、肺曲菌病的血清抗原检查
    1.胶乳凝集试验(Pastorex Aspergillus,法国Sanofi公司)检查血清中半乳甘露聚糖(Galactomannan)。方法如上述胶乳凝集试验。
    2.单抗ELISA法检查血清中半乳甘露聚糖抗原(法国Sanofi公司),敏感性达1.0ng/ml。
    3. DELFIA法。Eu标记的时间分辨荧光分析法(芬兰Wallac公司试剂)敏感性达0.5ng/ml。
    (三)、血清中查组织胞浆菌抗原
    以此菌荚膜的69-70kd抗原制出单抗以ELISA法检出可及时明确诊断。
    (四)、尿中检查马尼菲青霉菌抗原
    以该菌外壁的膜蛋白为抗原制出单抗,以ENA法诊断33例患者,52例健康人和248例无真菌感染的住院患者均为阴性。本法的特异性98%,敏感性97%,阳性予示值84%,阴性予示值99.7%。
    (五)、新形隐球菌的抗原检查
    新形隐球菌具有荚膜多糖抗原,可以单抗致敏的胶乳凝集试验快速检出。其荚膜多糖的主要成分为Glucuronoxylomannan,以此抗原的单抗包被酶标板,以双抗体夹心法检出抗原,血清稀释1:8为阳性。Feldmesset用此法自AIDS患者引发新形隐球菌性脑膜炎的血清中检出抗原而及时诊断。
    (六)、深部丝状真菌感染的抗原检查。
    丝状真菌的细胞壁成分含(1→3)β-D葡聚糖,可用鲎试剂(鲎凝固酶)检出。以20μg/ml为界限值。文献报告检查41例深部丝状真菌感染者,37例阳性,敏感率90%,特异性100%。
    三、 检查真菌的特异性酶
    白色念珠菌具N-乙酰-β-D半乳糖苷酶和脯氨酸氨肽酶,如用适当底物检测,此两酶同时阳性,即可确定。都柏林念珠菌只具N-乙酰-β-D半乳糖苷酶。克柔念珠菌具酸性磷酸酶,热带念珠菌具吡咯磷酸酶,平滑、副平滑念珠菌具β-D半乳糖苷酶,新形隐球菌具酚氧酶,均可用适当呈色底物快速完成鉴定。
    四、 分子生物学技术
    (一)、用PCR等技术字标本中扩增真菌DNA。国内应用PCR与反向斑点杂交快速检测及鉴定念珠菌主要种别。国外可以用PCR-DEIA技术从血清中扩增出白色念珠菌的DNA来诊断念珠菌病。
    针对真菌的共同序列而设计的‘全能引物’(pan-primer)而扩增580bp的产物,为真菌所共有。检测血液标本即可明确体内有无真菌感染。
    (二)、用于真菌的型别分析。国内应用随机引物PCR扩增后进行真菌分型,结果可靠。应用随机引物扩增物多态性分析(RAPD)可以将5种曲霉菌鉴别开(烟、黄、黑、土、构巢曲霉)。国外结合PCR与酶标记探针在纸条上进行检测(LiPA,line probe assay)可鉴别出主要的致病性真菌。
    (三)、检出念珠菌的基因变异快速确定念珠菌对酮康唑的耐药性。此种耐药性由基因的1554T突变为C而致,应用Lightcycler仪器,以荧光共振能量转移和基因片段溶解温度曲线技术测定。

     

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