医学真菌学检查是诊断真菌病的重要依据，随着真菌感染病例的日益增多，对实验室的诊断也提出了更高的要求。不论是患者浅部或深部感染诊断，几乎全依赖于临床标本的真菌学检查。特别是系统性真菌感染，其早期特异的诊断方法是挽救患者生命的关键，而病原真菌的形态结构十分多样，在不同条件下同一真菌也可有不同特点的形态。因此，在真菌的实验室检查中，必须熟练掌握各类真菌的形态特征以及在不同条件下的演变规律，才能获得对致病真菌正确的诊断。目前真菌感染的实验室检查方法主要包括常规检查法和特殊检查法两类。常规检查法主要包括：①形态学检查（直接镜检+染色镜检）。②培养检查。③组织病理学检查。特殊检查主要包括：①血清学方法。②分子生物学方法。

一、进行真菌实验室诊断的注意事项 
      ①应有独立实验室，不应与其他细菌、病毒等实验室共用，以防发生相互污染。②在每天工作前与工作后，工作台均要以消毒水例如5%石碳酸或0.5%过氧乙酸擦拭，如遇操作台被真菌或标本污染，应即覆盖纸巾，并用5%石碳酸消毒20min，切忌工作台污染后即用水冲洗，以免污染扩散。③培养菌检体及真菌污染的物质在丢弃前，必须高压灭菌或焚烧。④在进行真菌检查时，不可试着闻平板培养基特殊的气味。⑤不可对Histoplasma capsulatum 以及 Coccidioides immitis进行载玻片培养技术，因为其等具有高度感染性的孢子能够随着空气传播。⑥实验室禁止任意养花、草、动物等生物，以防实验污染。⑦工作环境应定期消毒。一般紫外线照射不能杀灭真菌，应用40%甲醛（可于每4㎡空间用35ml 40%甲醛加18g高锰酸钾在密闭情况下熏蒸24h，或用环氧乙烷进行消毒，每2～4周消毒1次。⑧如果用平板培养基接种标本，必须将平板培养基密封，以免发生危险，在不常做真菌检测的实验室，最安全的培养方法是利用含有棉花塞的试管培养基（使空气能够循环）。⑨美国梅育诊所主张利用平板培养基进行真菌的分离，步骤如下:平板培养基必须在生物安全箱内操作及检查。平板培养必须用胶带封好，平板培养基必须含30ml的量，并保持培养箱60%以上的湿度，同时增加琼脂的浓度至2%，以免脱水。⑩真菌的诊断，需要经验的累积及备有良好的图谱参考书。

 

二、分离及鉴定真菌的培养基

（一）   配制培养基的一般原则

①各成分混匀后以文火缓慢加热，并不断搅拌，煮沸1min，过热会破坏有效成分。②分装试管应在高压灭菌前，而分装平皿应在高压灭菌后。③高压灭菌一般在118～121磅,10～15min。④需加血液或不能高压的成分如抗生素，应在培养基冷却至50 左右时加入混匀。⑤试管分装量约7~8ml，平皿约15ml,如需培养4～6周，平皿内应有35～40ml的量。培养基中抗生素的浓度和添加方法：氯霉素、庆大霉素和放线菌酮能耐热，可在培养基高压灭菌前加入，其他抗生素均在培养基高压灭菌后冷却至45℃～50℃时加入。青霉素20～100μg/ml，链霉素40～200μg/ml，氯霉素50μg/ml，放线菌酮500μg/ml，庆大霉素5μg/ml。

 

（二）   分离和鉴定真菌的培养基

各种医学真菌所用培养基的成分，又可根据不同要求，分成分离、富集、选择、特性研究等含不同成分培养基，具体见表。

表  分离鉴定真菌培养基分类表

培养基种类 分离用培养基                                    使用目的
1.Brain heart infusion agar                                分离腐生性及病原性真菌
2.Brain heart infusion agar with antibiotics           分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌
3.Brain heart infusion biphasic blood 
Culture bottles                                                从血液中分离真菌
4.Dermatophyte test medium                               分离皮肤丝状菌，建议仅做筛检用
5.Inhibitory mold agar                                      分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌
6.Mycosel or mycobiotic agar                             分离皮肤丝状菌
7.Ssbouraud dextrose agar                                 分离腐生性及病原性真菌
8.Yeast estract phosphate agar                            分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌
区分试验培养基
1.Ascospore agar                                             检测产子囊孢子酵母菌
2.Cornmeal agar with Tween 80 and trypan blue     检测产厚膜孢子酵母菌
3.Cottonseed conversion agar                            使双相型真菌由霉菌型转变为酵母型
4.Czapek’s agar                                            分离及区分Aspergillus spp
5.Niger seed agar                                            鉴定Cryptococcus neoformans
6.Nitrate reduction medium                               检测Cryptococcus spp.还原nitrate能力
7.Potato dextrose agar 证实Trichophyton rubrumm   产色素能力制作载玻片培养技术
8.Yeast fermentation broth                                 测定酵母菌的发酵能力
9.Yeast nitrogen base agar                                 测定酵母菌的糖类同化能力

 

三、临床样本的采集与处理

（一）   皮屑  边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑，取材前75%酒精消毒，作KOH涂片，同时种于沙氏琼脂加氯霉素2管，置25℃培养2周。

（二）   甲屑  用细挫或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，标本用酒精浸泡待干燥后种于沙氏（SDA）培养4周，并同时作KOH涂片。

（三）   毛发  取病发（变色，无光泽，弯曲，脆易折断，松动易拔除）15根，75%酒精消毒，3～5根作直接镜检，5～10根种于沙氏琼脂（加氯霉素），划破斜面掩埋。

（四）   （四）脓液  无菌采集，注意颗粒，用无菌蒸馏水稀释后寻找。可作G染色或抗酸染色，常规的KOH涂片及SDA接种培养也是必要的。

（五）   CSF  采集于无菌试管3～5ml，立即送检。置冰箱不宜超过1h。离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1ml，作墨汁涂片镜检和培养（SDA）25℃或37℃4周。

（六）   血液  无菌抽血3～5ml立即于无菌抗凝管中，BHIB:血标本量为培养基量的1/10，37℃5～7d出现浑浊或菌团，挑取镜检同时移种SDA（注：每天检查完毕后需摇动培养基，37℃震荡培养可加速真菌的生长，提高检出率。不作直接检查，因其直接检查阳性率低。

（七）   体液、痰液、尿液、粪便  ①体液标本量10ml离心沉淀取2ml沉淀液做直接镜检培养。②晨痰3～5ml集于无菌瓶中(无菌生理盐水漱口数次后)，挑取黏液或脓性部分：KOH涂片培养。③早晨中段尿或清洁尿10ml，离心取沉淀液1ml做KOH涂片培养（SDA每管种0.5ml）。④拭子：一般尽量不用，缺点：A.不能得到足量的标本；B.采集的标本也不易从棉花纤维上分离下来;C.容易干竭。采集标本后应迅速放入内装1~2ml无菌蒸馏水的试管送检KOH涂片培养。⑤纸盒送检，挑取黏液、脓血、乳酪样部分KOH涂片培养（加抗生素）注：单纯培养阳性，不一定有临床意义，KOH涂片发现菌丝，有诊断意义。

（八）   组织：标本置无菌平皿中立即送检，置无菌匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或1～2mm3的小块，KOH涂片培养。