结核分支杆菌检验
 Mycobacterium tuberculosis

 

一、结核分支杆菌与结核病

n结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)俗称结核杆菌，属于分枝杆菌属(Mycobacterium)，可引起人和牛(主要是奶牛)、猪、禽类的结核病。该菌属是一类细长略弯曲的微生物，有时有分枝或出现丝状体。目前在分类学上已将分枝杆菌属归纳于放线菌中。主要有人型、牛型、禽型、鼠型和冷血动物型及非洲型。已知人型、牛型和非洲型对人有致病性。禽型可能也对人致病。

n牛，特别是奶牛对结核杆菌最易感。牛常见的结核病是肺、乳房、淋巴结结核，有时可见肠、生殖器、浆膜结核及全身性结核。猪主要表现为淋巴结核，最常患病的部位是颌下、咽、颈及肠系膜淋巴结。禽类主要对禽型结核杆菌敏感，主要侵害肝、脾等。

n人的结核以肺结核最为常见，此外有淋巴结核、肠结核、骨结核等。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。人感染结核病，除通过呼吸道途径外，还可通过动物性食品尤其是污染的牛乳经消化道而感染，病畜肉对人也有一定威胁。因此，牛乳或肉食品中的结核杆菌污染以及奶牛等畜禽的结核病在食品卫生方面具有重要意义，是预防人类结核病的重要环节。

nIn 1882, a few years after he discovered the bacillus responsible for anthrax, German physician Robert Koch (1843-1910) published his studies revealing the organism behind TB, Mycobacterium tuberculosis.  Suddenly, contaminated raw  milk, and it's role in infant ,mortality, became a lot  clearer.

 

二、生物学特性

(一)形态与染色特性

n结核分枝杆菌为细长略带弯曲、两端钝圆的杆菌，长1～4μm，宽0.2～0.5μm。牛分枝杆菌则比较粗短。无芽孢，无动力。在陈旧培养物或干酪化的淋巴结中可看到分枝状。分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，特别是有大量分枝菌酸(mycolic acid)包围在肽聚糖层的外面，可影响染料的穿入，若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌(acid-fast bacilli)。分枝杆菌一般用齐尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法，以5% 石炭酸复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸乙醇不易脱色。若再加用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中的物质为蓝色。

n近年发现结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜。一般因制片时遭受破坏而不易看到。若在制备电镜标本固定前用明胶处理，可防止荚膜脱水收缩。在电镜下可看到菌体外有一层较厚的透明区，即荚膜，荚膜对结核分枝杆菌有一定的保护作用。

(二)培养特性

n结核分支杆菌专性需氧。最适温度为37℃，低于30℃不生长。对营养要求较高，必须在含有血清或卵黄、某些无机盐和碳源(葡萄糖、甘油及丙酮酸钠)的特殊培养基上才能生长。即使在最适条件下生长仍很缓慢，需10～20d才能在固体培养基上出现可见菌落。常用的有罗氏(Lowenstein-Jensen)固体培养基，内含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可抑制杂菌生长，便于分离和长期培养。蛋黄含脂质生长因子，能刺激生长。菌落为浅黄色，小而干燥，不透明，表面粗糙、皱缩，形似菜花心。在液体培养基中一般1～2周即可生长，可形成菌膜，加入吐温-80(Tween-80)等表面活性剂，则可提高细菌生长率，并使其均匀生长。

(三)生化特性

各型结核杆菌均不发酵糖类，人型和牛型菌株能产生尿素酶。人型菌株还可还原硝酸盐，能产生烟酸。结核分枝杆菌大多数触酶试验阳性，而热触酶试验阴性。人结核分支杆菌和牛分支杆菌、鸟分支杆菌的特性比较见表6-3-1。

(四)抵抗力

n本菌对干燥的抵抗力特别强。粘附在尘埃上保持传染性8～10d，在干燥痰液中可存活6～8个月。结核分支杆菌细胞壁中含有脂质，故对乙醇敏感，在70%乙醇中2min死亡。结核杆菌对紫外线敏感，直接日光照射数小时可被杀死，可用于结核患者衣服、书籍等的消毒。对常用消毒剂如石炭酸有较强的抵抗力。在4%NaOH(W/V)、3%HCl(W/V)或6%硫酸(W/V)中30min活力不受影响(因此可用此法进行有杂菌污染检样的预处理)。对湿热敏感，经60℃、30min或80℃、5min死亡，巴氏消毒法可有效杀死本菌。结核杆菌对1﹕13 000孔雀绿有抵抗力，加在培养基中可抑制杂菌生长。

 

三、检验

一)结核杆菌的常规检验      包括显微镜检查、细菌培养、动物试验、结核菌素试验等。

1. 显微镜检查

n用检样制涂片，进行齐-尼氏抗酸染色和革兰氏染色，镜检。若被检材料是痰液或病灶，则检出革兰氏阳性的抗酸菌即可初步判断；而在牛乳、粪便、尿液中检出抗酸菌，必须再进一步鉴定。

    2. 细菌检查

n(1)浓缩集菌：先集菌后检查，可提高检出率。脑脊液和胸、腹水无杂菌，可直接离心沉淀集菌。痰、支气管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4% NaOH(痰和碱的比例为1:4,尿、支气管灌洗液和碱的比例为1:1)处理15min。尿标本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于锥形量筒内静置，取沉淀物处理。处理后的材料再离心沉淀。取沉淀物作涂片染色镜检。若需进一步作培养或动物接种，应先用酸中和后再离心沉淀。

n(2)固体培养法：取检样接种于固体培养基，分别置暗处和有光处，37℃培养4～8周后观察。根据生长快慢、菌落特性、色素产生情况及抗酸性强弱做出判断。如培养特性不典型，则须进一步鉴定。

n(3)玻片培养法：检样经浓缩集菌后，涂布于灭菌小玻片上(不固定)，置于有血液或血清的液体培养基中，37℃培养5～7d，取出染色检查。

    3. 动物试验    分离细菌、测定毒力及分型时均可应用。常用豚鼠或地鼠。将检样注射于腹股沟皮下，3～4周后如发现局部淋巴结肿大或结核菌素试验阳性，即可剖检，观察淋巴结、肺、肝等脏器有无病变，并进行涂片染色镜检及细菌培养。动物接种的阳性率较染色镜检和细菌培养高，但耐异烟肼菌株毒力明显减弱，会影响实验结果。若6～8周仍不见发病，也应进行解剖检查。

4. 结核菌素试验   

作为诊断结核病的方法，在人只适于婴幼儿；在动物检疫中多应用于牛，鸡和其它动物必要时也可应用。

结核菌素试验是牛结核病检疫时的主要方法，有皮内法、点眼法和皮下法3种。最好将前两种方法同时并用，即用旧结核菌素(old tuberculin，OT)或纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)同时进行皮内注射和点眼。根据注射部位的热痛、肿胀等炎症反应，以及眼结膜反应、眼睑肿胀状态和眼分泌物的质与量进行判断。皮内接种和点眼任一方法呈阳性，即为结核菌素试验阳性。

    禽类检疫时，用禽型结核菌素0.1mL注射于鸡的肉垂内，以48h出现肿胀和发红为阳性。

二)其它检验方法

    1. 荧光染色法    将检样涂片固定，然后用0.1%金胺石炭酸溶液染色，再用3%盐酸酒精脱色，最后以美兰饱和酒精溶液复染，于荧光显微镜下检查。若视野中有黄绿色明亮荧光的杆菌，即可作初步判断。该法比常规抗酸染色法检出率高。

2. 生化试验    生化试验是鉴定结核杆菌的快速方法。主要包括烟酸试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验、尿素酶试验及β-葡萄糖苷酶试验等。

3. 血清学试验    血清学方法如间接血凝试验、ELISA、放射免疫测定、免疫荧光等，其中ELISA是目前检测结核病抗体的最好方法，对人的活动性结核检出率为55%～90%，对动物结核的检出率为50%～60%。

4. PCR快速诊断　　一般涂片检查菌数需5´103～5´104/mL，培养需1´102/mL，少于此数时不易获得阳性结果，且培养需时较长。目前已将多聚酶链反应(PCR)扩增技术应用于结核分枝杆菌DNA鉴定，每毫升中只需含几个细菌即可获得阳性结果，且1～2d得出结果。