炭疽杆菌检验
 Bacillus anthracis

 

一、炭疽杆菌与炭疽病

n炭疽杆菌(Bacillus anthracis)：人类最早认识和注意的重要病原菌之一，是炭疽病的病原体。

n炭疽病(Anthrax)是一种人兽共患的急性、热性、败血性烈性传染病，呈世界性分布。一年四季均可发生，以夏、秋季节较高。其易感动物之多，仅次于狂犬病。

n家畜中以牛和绵羊最易感，常呈超急性、急性经过，表现为突然倒地，呼吸困难，全身痉挛，高热，可视黏膜发绀，天然孔出血，血凝不良，尸僵不全；山羊、马、驴、骡、水牛、骆驼次之；猪有较强抵抗力，常呈慢性经过，表现为咽唊炎型、肠型和肺型。    炭疽：血液呈煤焦油状

n人类常因食用带有该菌的食物、饮水或与患炭疽死亡的动物及其畜产品接触而通过消化道、呼吸道或皮肤粘膜而感染，表现为皮肤、肺、纵隔及肠道的急性感染，有时伴有炭疽杆菌败血症。肠型炭疽和肺型炭疽常表现为急性败血症经过，病死率很高。1923～1940年前苏联爆发6次肠型炭疽，其中最严重的一次是由病畜肉制成的腊肠引起的，27例病人无一幸存。

n本菌可通过患病动物血液、分泌物、排泄物，或死亡病畜的尸体、组织、脏器、体液、骨骼、皮毛等污染土壤、空气、江河、池塘甚至食物和饮水，尤其是病畜的血液，可以成为感染人类、污染环境的重要来源。

n炭疽杆菌繁殖体的抵抗力不强，但其所形成的芽孢对外界环境的抵抗力极为强大，可长期存活。自然环境一旦被芽孢污染，则成为长久的疫源地而不易清除，长期危害人类和动物。因此，采取有效措施防止本菌的污染和传播，在人兽共患病防治和食品卫生学方面具有重要意义。

Cutaneous anthrax vesicle development. Day 4: Black eschar, redness remains.

Cutaneous anthrax vesicle development. Day 4: Notice the edema and typical lesions.

 

二、生物学特性

(一)形态染色特性

n炭疽杆菌归需氧芽孢杆菌属，革兰氏阳性粗大杆菌，大小为1.0～1.2µm ´ 3～5µm。无鞭毛，不能运动。在人和动物体内常呈单个散在或呈短链状，菌体两端平截，周围形成粘液样肥厚荚膜，似竹节状。在血液、血清琼脂平板上或加有碳酸氢钠的琼脂平板上，于10%～20% CO2环境中培养，也可形成荚膜。荚膜比菌体更耐腐败，因此在腐败组织中往往不见菌体而只见“菌影”(荚膜的轮廓)。在人工培养物内和自然界中，一般不形成荚膜，常呈长链状。

n能形成卵圆形芽孢，芽孢位于菌体中央。形成芽孢的条件：氧气充足、温度适宜(25℃～30℃) 。

nAnthrax. Toluidine blue (甲苯胺蓝)stain. Bacillus anthracis in a bovine spleen. Anthrax bacilli in tissue seen in short chains surrounded by a common capsule.

n Coloured scanning, electron micrograph (SEM) of anthrax bacteria (Bacillus anthracis), the cause of the disease anthrax in humans and livestock.

(二)培养特性

n本菌对营养要求不严格，在一般培养基上即可生长。生长温度范围14℃～44℃ ，最适温度30℃～37℃。pH范围6.0～8.5，最适pH7.2～7.6。

n普通琼脂：强毒株18～24h形成扁平、粗糙、表面干燥、灰白色、不透明、边缘不整齐的火焰状菌落，在低倍显微镜下，可见菌落边缘呈卷发状，用接种针探触，有粘滞感，挑之，可拉起丝。弱毒株或无毒株形成光滑菌落，菌落稍小而隆起，边缘较整齐。

n普通肉汤：管底有絮状沉淀物，整个培养液澄清，如轻轻摇动试管，可见沉淀物卷绕成团，往上升起。不形成菌膜或菌环。

n血琼脂平板：菌落周围无明显的溶血环，但培养较久后可出现轻度溶血，菌落周围不透明。菌落有粘性，用接种针钓取可拉成丝，称为“拉丝”现象。

n明胶穿刺：只沿穿刺线生长，培养2～3d后明胶呈漏斗状液化，上部向外扩展呈白色的倒立松树状。

(三)生化特性

n本菌能分解葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、菊糖、蕈糖和果糖，产酸不产气；不分解乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露醇、乳糖、甘露醇、山梨醇和卫茅醇；有些菌株可迟缓发酵甘油和水杨苷。

n不能利用枸橼酸盐；不分解尿素；能水解淀粉和乳蛋白；通常可还原硝酸盐为亚硝酸盐；不产生靛基质和硫化氢，V-P试验不定；苯丙氨酸脱氨酶和磷酸酯酶阴性，接触酶阳性；牛乳经2～4d凝固，然后慢慢胨化。

Anthrax is an acute infectious disease caused by the bacterium Bacillus anthracis. Anthrax is primarily a disease of domesticated and wild animals, particularly herbivores such as cattle, sheep, horses, mules and goats.

B. anthracis was so called after the Greek word for black coal ('anthracis'), due to the black necrotic ulcers characteristic of cutaneous anthrax infection.

The bacterium produces spores which can survive dormant in the soil for many years and although human anthrax is fairly rare, infection occurs incidentally through contact with diseased animals or by inhaling anthrax spores from contaminated animal products such as flesh, bones, hides, hair and excrement.

(三)血清学特性

n目前已知有4种抗原成分：保护性抗原、荚膜抗原、菌体抗原和芽孢抗原。

1、保护性抗原：是炭疽杆菌生活过程中产生的一种细胞外蛋白质，为炭疽杆菌毒素的组成部分，有免疫原性，其相应的抗体能使动物抵抗本菌的感染作用。

2、荚膜抗原：由D-谷氨酰多肽组成，是一种半抗原，与毒力有关，仅见于有毒菌株；该抗原产生的抗体对动物无保护作用，但具有较特异的抗原性，由此建立起用于鉴定菌种的荚膜肿胀试验和测定患者血清荚膜抗体的免疫荧光法等，均能获得较好的效果。

3、菌体抗原：有2种。一种为多糖半抗原，存在于细菌细胞壁和菌体内，耐热，比较稳定，与毒力无关；常用的炭疽沉淀反应(Ascoli反应)就是通过检测此抗原而判定炭疽污染的；有种的特异性，但特异性不高，能与其它需氧芽孢杆菌等发生交叉反应。另一种是菌体蛋白质抗原，具有对细菌自身的保护作用。

4、芽孢抗原：位于芽孢的外膜，具有免疫原性和血清学诊断价值。

 

三、检验

(一)检验程序    见《动物性食品检验学》第六章。

(二)细菌学检查

1.显微镜检查：取待检材料制成涂片，用荚膜染色法及革兰氏染色法染色后镜检。革兰氏染色可见G+ 粗大杆菌。荚膜染色法菌体呈深紫色，荚膜淡紫色；碱性美兰染色可将菌体染成蓝色，荚膜为淡粉红色。

2.分离培养：一般分离培养采用血琼脂平板。污染严重的标本，可在处理后接种于炭疽杆菌选择性琼脂平板，如戊烷脒血琼脂平板。经37℃10h～24h培养后，进行菌落检查和鉴别试验。

在戊烷脒血琼脂平板上，多数其它芽孢杆菌受到抑制，而炭疽杆菌仍可生长，但也受到轻度抑制。菌落生长较慢较小，不溶血，呈卷发状。

3.鉴别试验

(1)明胶穿刺：沿穿刺线形成白色的倒立松树状生长，可证实为炭疽杆菌。

(2)串珠试验：在适当浓度的青霉素(0.05～0.5 IU/mL)作用下，炭疽杆菌细胞壁粘肽的合成被抑制，使菌体膨大，形成大而均匀的圆球状，类似串珠。这种现象为炭疽杆菌所特有，可与其它需氧芽孢菌鉴别，且与常规检查符合率高达80% ～90%。常用方法有肉汤法和琼脂薄片法。

(3)串珠荧光抗体染色法：本法结合了串珠试验和荧光抗体染色法的特点，具有双重特异性，有助于与其它需氧菌的区别。

(三)其它检验方法        主要介绍如下几种方法。

1. 荚膜荧光抗体染色法                                        

2. 荚膜肿胀试验

3. Ascoli’s反应(环状沉淀试验)   该方法自1902年由Ascoli首次提出后，一直被广泛应用，适用于疑似炭疽死亡动物的病料、干的皮张、陈旧及污染严重的炭疽病料等。但该法特异性和敏感性较差，因此其应用有一定局限性。

4. 乳胶凝集试验

5. 青霉素抑制试验    每1mL培养基中含青霉素10 IU时，可抑制炭疽杆菌的生长，而其它需氧芽孢杆菌生长不受影响。

6. 噬菌体裂解试验