目的

1.1  学习接目测微计的校正方法， 了解血球计数板的构造和计数原理

1.2 学习使用显微镜测微尺测定微生物细胞大小，  掌握用血球计数板测定微生物细胞总数的方法。

2  原理

微生物细胞的大小是微生物分类鉴定的重要依据之一。微生物个体微小，必须借助于显微镜才能观察，要测量微生物细胞大小，也必须借助于特殊的测微计在显微镜下进行测量。

显微测微计由镜台测微计和目镜测微计两部分组成。后者可直接用于测量细胞大小。它是一块圆形玻片(图7—1)，其中央有精确等分到度，测量时将其放在接目镜中的隔板上。由于目镜测微计所测量的是微生物细胞经过显微镜放大之后所成像的大小，刻度实际代表的长度随使用的目镜和物镜放大倍数及镜筒的长度而改变，所以，使用前须先用镜台测微计进行标定，求出某一放大率下，目镜测微计每一小格所代表的长度，然后用目镜测微计直接测被测对象的大小。镜台测微计是一块中央有精确刻玻片(图7—1)，刻度的总长为lmm，等分为100小格，每小格长10um，专用于对目镜测微计进行标定的。

3  材料

3.1  器械

显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺，载玻片、盖玻片、血球计算板、擦镜纸、吸水纸、玻片架、肾形盘、洗瓶、接种环、酒精灯、火柴、滴管。

3.2  菌种

培养48h的啤酒酵母斜面菌体和菌悬液。

3.3  革兰氏染液

4流程

4.1 置目测微计→置台测微计→标定目测微计→测菌体大小→记录结果→用毕擦拭干净

4.2 检查计数板→稀释样品→加样→计数→计算→清洗

5  步骤

5.1  微生物菌体大小的测定

5.1.1  目镜测微尺的校正

5.1.1.1  更换目镜镜头 

更换目镜测微尺镜头（标记为PF）；或者取下目镜上部或下部的透镜，在光圈的位置上安上目镜测微尺，刻度朝下，再装上透镜，制成一个目镜测微尺的镜头。

5.1.1.2  某一倍率下标定目镜刻度

将镜台测微尺置于载物台上，使刻度面朝上，先用低倍镜对准焦距、看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器使两尺重叠，并使二尺的左边的某一刻度相重合，向右寻找另外二尺相重合的刻度。记录两重叠刻度间的目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数(图7-1C)。

5.1.1.3  计算该倍率下目镜刻度 

目镜测微尺每格长度=镜台测微尺格数/目镜测微尺格数xl0um

5.1.1.4  标定并计算其他放大倍率下的目镜刻度

以同样方法分别在不同倍率的物镜下测定目镜测微尺每格代表的实际长度。如此测定后的测微尺的长度，仅适用于测定时使用的显微镜以及该目镜与物镜的放大倍率。

5.1.2  菌体大小的测定

5.1.2.1  将啤酒酵母制成水浸片。

5.1.2.2  大小换算

将标本先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺测定每个菌体长度和宽度所占的刻度，即可换算成菌体的长和宽。

5.1.2.3  求平均值

一般测量微生物细胞的大小，用同一放大倍数在同一标本上任意测定l0一20个菌体后，求出其平均值即可代表该菌的大小。

5.2  用血球计数板测定微生物细胞的数量

5.2.1  检查血球计数板 

取血球计数板一块，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸着的菌体，若有污物则通过擦洗、冲洗，使其清洁。镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时才可使用。

5.2.2  稀释样品

将培养后的酵母培养液振荡振摇混匀，然后作一定倍数的稀释。稀释度选择以小方格中的分布的菌体清晰可数为宜。一般以每小格内含4～5个菌体的稀释度为宜。

5.2.3  加样

取出一块干净盖玻片盖在计数板中央。用滴管取1滴菌稀释悬液注入盖玻片边缘，让菌液自行渗入，若菌液太多可用吸水纸吸去。静置5—10分钟。

5.2.4  镜检

待细胞不动后进行镜检计数。先用低倍镜找到计数室方格后，再用高倍镜测数。一般应取上下及中央五个中格的总菌数。计数时若遇到位于线上的菌体，一般只计数格上方（下方）及右方（左方）线上的菌体。每个样品重复3次。

5.2.5  计算 

取以上计数的平均值，按下列公式计算出每毫升菌液中的含菌量。

菌体细胞数（cfu/mL）＝小格内平均菌体细胞数×400×104×稀释倍数

5.2.6  清洗 

计数板用毕后先用95%的形酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸揩干净。若计数的样品是病原微生物，则须先浸泡在5%石炭酸溶被中进行消毒，然后再行清洗。清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。

图7-2 血细胞计数板

6  结果

6.1计算出目镜测微尺在低、高倍镜下的刻度值。

6.2 记录菌体大小的测定结果。

6.3 计算样品中酵母菌浓度。

7  思考

7.1  为什么随着显微镜放大倍数的改变，目镜测微计每格相对的长度也会改变？能找出这种变化的规律吗？

7.2  根据测量结果，为什么同种酵母菌的菌体大小不完全相同？

7.3  能否用血球计数板在油镜下进行计数？为什么？

7.4 根据自己体会，说明血球计数板计数的误差主要来自那些方面？如何减少误差？ 

8 附录

目镜测数尺有两种：一是特制的目镜镜头，镜片上刻有50等分或100等分的刻度，使用时直接安装在显微镜上，取代没有刻度的目镜镜头；另一种是一块直径大约17.5 mm的圆玻璃片，其中央刻有50等分或100等分的刻度(图7-1A)，使用时将该玻璃片安装在原来的目镜镜头上即可。由于不同的显微镜放大倍数不同，既使同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下其放大倍数也不同，故目镜测微尺每格实际表示的长度随显微镜放大倍数不同而异。也就是说，目镜测微尺上的刻度只代表相对的长度。因此在使用前须用镜台测微尺校正，以确定在一定放大倍数下目镜测微尺的每格长度。

血球计数板是一块特别的厚玻片，玻片中央分剖成两个平面，上面各刻有9区，中央一区为计数室，供计数用(图7-2A)，此区的长和宽各为1mm。中央平面两侧有小沟，小沟外有两条突起的平台，平台比中央平面高0.1mm，因此计数室体积为0.1mm³，容积为10^-4ml。通常计数室分为25个大格，每大格又分为16个小格，每小格容积为4×10^-6ml，即lml菌液容积相当于400万个小格体积。因此只要将细胞悬液注人计算室，计算出一定数量小格的平均菌数即可算出每毫升的细胞数。