2005 年版药典无菌检查法和微生物限度检查法的最重大增订是要求对检验方法进行验证，及对验证方法给出了系统的规定。 这是我国药品微生物学检查方法与先进国家药典接轨、符合国际人用药品注册技术要求协调会（ICH ）的要求、迈向科学化、合理化的一个重要标志，也是促进我国药品微生物学检查标准化建设的重要途径。为了确保开展微生物学检验方法的验证，国家局、药典会、中检所都先后发布了要求执行验证的相关法规和文件[1]

一、验证的必要性和意义（Why）

1 、随着科学技术的迅速发展，药品质量标准中的鉴别、有关物质、含量测定等项的检测方法都不断地在精密度、准确度上逐步提高。但2005 年版以前的药典对药品微生物污染检查方法的准确性、可靠性基本无要求，造成长期来在药品生产工艺、药品检验、药品技术审评中对与人民用药安全有效密切相关的微生物污染监控、监测方法缺乏警惕和衡量的标准，与先进国家的药典和药品技术审评要求脱节。

2 、对所用的检验方法进行验证，是分析测量科学的基本要求，是各种法规遵循工作的基础。药品微生物学的检查作为整个药品质量体系中的一个环节，也应与化学分析的严谨要求靠拢，保证检验结果的准确可靠。

3 、通过验证试验，可对每种药品的具体检验方法的可靠性及结果的准确性予以确认，从而形成标准化的操作。这是促进药品无菌、微生物限度检查走向标准化的重要途径。

4 、通过对同品种但不同批号或不同生产厂家的产品的微生物学验证试验比较，可以发现产品所用原料质量或工艺流程中是否存在污染抑菌物质的问题，具有药品质量控制的意义。

二、开展验证的思路和程序

1 首先了解供试品是否有抑菌性、抑什么菌。

2 考虑和选择出适当的方法消除或降低供试品的抑菌性。

3 用实验证明你所用的方法已消除抑菌性——能使人工加入的各种试验菌生长良好。特别是能满足对产品最敏感菌的生长。

4 将所作实验记录在案—— 即为确认该供试品在该检验量，在该检验条件下已充分消除抑菌性，能确保实验结果正确可靠的验证试验结果报告。

以上4 点思路和程序也是对验证报告进行技术评价和审核时必须注意和考察的4 点。

三、验证的重点是什么？（what ）

无菌、微生物限度检查的验证试验可概括描述为：在采用的检验方法和过程中，通过分别加入规定量的代表性微生物，以试验供试品是否在规定的检验量、在所采用的检验条件下1ഊ无抑菌性，或已充分消除了抑菌性（供试品本身的以及操作系统中可能对微生物生长有影响的各种因素），并且所用方法对微生物生长无不良影响，从而确认检验方法的有效性，保证检验结果的准确可靠。因此，整个实验过程中的每一个环节均应有合理的证明，保证其对结果判断没有影响。按样品的检验流程，验证的重点环节分布如下：

样品

需前处理

不需前处理

有抑菌作用

无抑菌作用

去除抑菌作用

①验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。

③验证抑菌活性去除方法的有效

性及对污染菌检出无影响。

②通过验

证实验判

检验

What1 ：验证制成适宜供试液的前处理方法，证明方法对微生物生长、检出无影响。

What2 ：验证样品有无抑菌性、抑什么菌 ？最敏感的菌是那一个？其结果将直接影响

下续检验方法的选择和操作步骤的进行，并是最终所选检验方法和操作步骤合理性的证明。

What3 ：验证消除样品抑菌活性的方法，证明方法的有效性及方法对污染菌生长无影响。

如何选择合理、适宜、简单有效的消除抑菌活性的方法是当前验证工作的关键。

验证报告对以上3 个环节的情况是否都有交待；所采用的方法是否科学、合理、有效，并且提供了实验的证明，也是对验证报告进行技术评价和审核时必须注意考察的3 点。

四、怎么验证？（How ）

按药典对样品无菌检查的规定和要求，或是微生物限度检查的规定和要求进行，对每一试验菌应逐一进行验证试验。微生物学的验证试验一般分 4 个步骤进行：

1 、制备验证试验用菌液——How1 ：

按药典无菌检查法中培养基灵敏度检查项中试验用菌液制备的方法将规定需用的试验菌分别制成每毫升中含10 ～100 个菌（CFU ）的供试菌液。验证报告中应给出各种试验用菌液的制备和菌液含菌量计数的原始记录。

2 、样品的前处理方法——How2 ：

为达到制备成均匀的供试液及为后续采取消除抑菌活性的方法作准备，将所采取的前处理方法应用和参加到验证试验中，以证明所用处理方法对各试验菌的生长无影响。

按供试品的性状选用以下适宜的方法，或几种方法联合使用：

溶解：—— 验证所用溶液、助溶剂和水浴助溶温度对微生物生长无影响。

乳化：—— 验证所用乳化剂和水浴助溶温度的有效性、使用量及对微生物生长无影响。

破乳：—— 验证所用破乳剂的有效性、使用量及对微生物生长无影响。

萃取：—— 验证有机相选择的合理性、有效性及对微生物生长无影响。

2稀释：—— 验证降低供试品相对抑菌浓度的有效稀释倍数。

离心：—— 验证所用转速、时间和微生物的分布情况。

验证报告中应有采取某种前处理方法的原因有说明，并记录操作步骤以增加重现性。样品如不需要特别的前处理就能制成均匀的供试液，那么这一步骤可省掉，直接进入确定样品有无抑菌性的How3

3 、确定供试品是否有抑菌性、抑什么菌——How3 ：

可通过查阅临床药物实验手册、文献资料（特别是杂志“Drug”，每一种新药上市，都有专门的综述）、申报资料中的药效学资料，关注其对不同细菌的MIC 情况、参考已经验证过的品种、抗菌药物可根据抗菌谱确定其敏感菌、中成药如果抗菌谱不清楚，至少需选择一株细菌和一株真菌来试验等方法。也可直接通过验证实验确定之。

用实验确定是否具有抑菌性的方法：在规定量的供试液中加入实验用微生物10~100 个，如微生物生长良好，即说明供试品对该种微生物无抑菌活性。如已用药典规定的各试验菌试验，结果均能生长良好，说明供试品无抑菌性，可用常规方法检验之。 将这些试验记录在案——就是证明该供试品无抑菌性的验证试验部分；如加入的微生物不生长或生长缓慢，说明供试品有抑菌性，将这些试验记录在案——就是证明该供试品有抑菌性的验证试验部分；如加入的微生物中有某一种菌最不能生长或生长最缓慢，这一种菌就是该样品的敏感菌。

4 、选择适当的方法消除或有效降低供试品的抑菌活性——How4 ：

根据供试品特性选择药典规定的消除供试品抑菌活性的方法（一种或几种联合），或利用药物化学知识，寻找出其他合理、有效的方法，特别是有效的中和剂（这是值得鼓励的发展方向）。并通过模拟实验（验证试验）对消除或降低抑菌活性的效果加以检验。

无菌检查中可采用：① 薄膜过滤法 ② 中和法（目前药典仅收载β－内酰胺酶处理法）。

①薄膜过滤法——适用于液体供试品和可溶于水的固体供试品（只要性状许可，应首先采用）。验证和对验证结果技术评价的重点是：确定滤膜的适用性、确定冲洗的方法和冲洗液的用量。

②中和法——适用于有对应性，能充分被其灭活抑菌活性的样品（如β－内酰胺酶灭活β－内酰胺类抗生素、对氨基苯甲酸灭活磺胺类）。验证和对验证结果技术评价的重点是：

确定中和剂的有效、证明对污染微生物的生长无毒性、加入的方法和加入量。

在检验制剂是否已消除或降低抑菌活性的验证试验中，每种试验菌为一组，每组两管，其中一管为供试品加试验菌管，另一管为试验菌对照管。

验证试验和对验证结果技术评价的判断为：如平行3 次的试验中，各管微生物均生长良好，说明供试品已消除了抑菌活性。可以确定按该方法进行该品种的无菌检查；如有供试品管的微生物生长微弱、缓慢或不生长，说明供试品仍有抑菌活性，应考虑进一步增加冲洗量或中和剂的用量以消除抑菌活性，并重新验证，直至验证证明已充分消除或有效降低抑菌活性。

微生物限度检查中可采用：

① 培养基稀释法 ② 离心沉淀法 ③ 薄膜过滤法 ④ 中和法。

①培养基稀释法——取规定量的供试品/供试液加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品浓度降低至不显抑菌作用。适用于不能用薄膜过滤法而且抑菌活性较弱的样品。验证和对验证结果技术评价的重点是：确定培养基量增加至多少才能使供试品/供试液不显抑菌活性。

②离心沉淀法——利用沉降系数差异分离去掉药渣、含抑菌活性的部分，留下含微生物的部3分。适用于不能用薄膜过滤法等方法的样品。验证和对验证结果技术评价的重点是：确定能将药渣、抑菌成分部位分离掉而留下微生物部位的有效的离心率。

③薄膜过滤法——同上无菌检查法中所述。并常可与离心沉淀法联合使用消除抑菌活性。

④中和法——同上无菌检查法中所述。

实践证明几种方法联合使用效果更好。其中薄膜过滤法和中和法是最有效的消除抑菌性

的方法。验证报告中应对样品所采取的某种消除抑菌性的方法的原因有说明，并详细记录操作重点和步骤以增加重现性。

由于制剂的微生物限度检查由菌数计数和控制菌检查两部分组成，所以，在检验是否已消除或有效降低抑菌活性的试验中也应分别进行验证。